迷迭香酸通過調(diào)控自噬抑制高糖誘導(dǎo)的HRMEC血管生成

李蓉，陳琳，李亞，馬雅玲，周凌霄

糖尿病的全球患病率正逐年快速增長，已成為繼心腦血管疾病及腫瘤之后的第三位危害人類健康的慢性非傳染性疾病[1]。糖尿病并發(fā)癥是糖尿病患者發(fā)病和死亡的主要原因，其中，糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥[2]。臨床上將DR分為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變 （nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變 （proliferative diabetic retinopathy，PDR）兩大類，視網(wǎng)膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）的形成是疾病發(fā)展為PDR的標(biāo)志，其繼發(fā)的玻璃體積血和視網(wǎng)膜脫離是患者視力喪失的主要原因[3]。

迷迭香酸（rosrarinicacid，RA）是一種天然水溶性的多酚羥基化合物，廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物中[4]。研究[5-6]表明，RA具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌和抗病毒等多種藥理作用。在很多疾病中顯現(xiàn)出極大的治療潛能，然而，RA是否對DR有效尚缺乏研究。自噬是廣泛存在于各種真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性降解途徑，是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的一種重要機(jī)制，在維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等機(jī)體生理過程中起著非常重要的作用[7-8]。已有研究[9-10]證實(shí)，自噬參與RNV的血管形成過程。基于此，本研究觀察RA對高糖條件下的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC）增殖、遷移和管腔形成的作用以及其與自噬之間的關(guān)系，旨在闡明RA對DR的效應(yīng)及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRMEC）（上海中喬新舟生物科技有限公司，中國）。M199培養(yǎng)基、胎牛血清及0.25%胰酶（Gibco公司，美國）；青鏈霉素（索萊寶公司，中國）；迷迭香酸（RA）（上海恒斐生物科技有限公司，中國）；MTT（Sigma公司，美國）；二甲基亞砜（DMSO）（Amresco公司，美國）；Transwell小室、Matrigel（BD公司，美國）。細(xì)胞RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜（0.45 μm，Millipore公司，美國）；兔多抗LC3-II/LC3-I（14/16KD，Affinity公司，美國）；兔單抗Beclin-1（52KD，Abcam公司，英國）；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；ECL底物液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。CO2恒溫培養(yǎng)箱（MCO-15AC型，SANYO，日本）；倒置相差顯微鏡（IX51型，Olympus，日本）；低速離心機(jī)（5702R型，Eppendorf，美國）；全自動酶標(biāo)儀（Multiskan MK3型，Thermoscientific，美國）；透射電子顯微鏡（HT7700-SS型，HITACHI公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將解凍后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5 ml M199培養(yǎng)基的離心管中，離心收集細(xì)胞，棄上清，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的M199培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，接種到培養(yǎng)皿中，吹打混勻，在5%CO2、37℃充分濕化條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的密度達(dá)到80%時，按1:3的比例傳代。

1.2.2細(xì)胞分組及處理將細(xì)胞隨機(jī)分為5組。正常對照組（NC組）：在低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；高糖組（HG組）：在培養(yǎng)基中加入30 mmol/L D-葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)；低濃度RA組（LC組）：培養(yǎng)基中加入25 μmol/L RA+30 mmol/L D-葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)；中濃度RA組（MC組）：培養(yǎng)基中加入50 μmol/L RA+30 mmol/L D-葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)；高濃度RA組（HC組）：培養(yǎng)基中加入100 μmol/L RA+30 mmol/L D-葡萄糖進(jìn)行培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在5%CO2、37℃充分濕化條件下培養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1MTT法檢測細(xì)胞增殖 將HRMEC體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的M199培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃充分濕化條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取指數(shù)期生長的細(xì)胞，先用M199完全培養(yǎng)基將細(xì)胞配置成單個細(xì)胞懸液，然后采用倍比稀釋法，調(diào)節(jié)細(xì)胞的濃度為5×104個/ml，最后將調(diào)節(jié)好濃度的細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100 μl。將接種細(xì)胞的96孔板放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜，吸出舊培養(yǎng)基，按照不同分組加入相應(yīng)的試劑。同時，分別設(shè)調(diào)零孔和對照組，把加好樣的96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μl MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，小心棄掉上清液，然后每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀568 nm處測量每孔的OD值。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的增殖率：增值率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD對照組）/（OD對照組-OD空白組）×100%。其中，空白組及調(diào)零孔僅含有培養(yǎng)基而沒有接種細(xì)胞，對照組用M199完全培養(yǎng)基按常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3.2Transwell法檢測細(xì)胞遷移 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后按照每孔5×105個接入6孔板，5%CO2、37℃充分濕化條件下培養(yǎng)過夜。0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后離心，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個/ml。在配套的24孔板孔內(nèi)加入800 μl含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，將Transwell小室放進(jìn)24孔中，確保沒有氣泡（每組設(shè)3個復(fù)孔）。取無血清細(xì)胞懸液200 μl加入Transwell小室的上室中，常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出上室，將未穿膜的上室內(nèi)細(xì)胞用濕棉簽擦去，70%冰乙醇固定細(xì)胞1 h。移到0.5%結(jié)晶紫染液的孔中染色20 min。蒸餾水沖洗，風(fēng)干小室，剪下小室膜，晾干，二甲苯和中性樹膠（按1:1的比例）封片。干燥后置于正置顯微鏡下隨機(jī)選擇3個高倍視野拍照，計(jì)算穿過Transwell小室膜的平均細(xì)胞個數(shù)。

1.3.3Matrigel基質(zhì)膠法檢測細(xì)胞管腔形成提前1 d將-20℃保存的Matrigel基質(zhì)膠置于4℃環(huán)境中解凍，在24孔板中加入200 μl Matrigel基質(zhì)膠，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中凝固待用。取各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，0.25%胰酶消化，然后用無血清M199培養(yǎng)基重懸至2×105個/ml，按1 ml/孔加入到鋪有Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中，每組3孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 h觀察1次，當(dāng)管腔形成時立即于顯微鏡下拍照（一般為6～8 h，≥3個細(xì)胞/分支），隨機(jī)選取100倍下的3個視野，用Image軟件對管腔形成數(shù)進(jìn)行計(jì)算，取平均值。

1.3.4透射電鏡觀察自噬泡 各處理組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，0.25%胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用2.5%戊二醛固定6 h，無菌PBS緩沖液漂洗2次，然后用1%鋨酸固定2 h，連續(xù)梯度乙醇法細(xì)胞脫水，Embed-812媒介環(huán)氧樹脂包埋48 h，制備60 nm超薄切片，經(jīng)醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色，待切片干燥后在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變，以判斷細(xì)胞自噬泡（自噬小體、自噬溶酶體）的形成情況。自噬小體多為雙層或多層膜性液泡狀結(jié)構(gòu)，里面包含胞漿成分，如核糖體、線粒體等。自噬溶酶體多為單層膜，胞漿成分大多消失、降解，無完整結(jié)構(gòu)。

1.3.5Western blot法檢測自噬蛋白LC3、Beclin-1的表達(dá) 取處于對數(shù)生長期且生長良好的HRMEC接種于六孔板（5×105個/孔）中培養(yǎng)24 h后，根據(jù)不同分組處理細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，終止藥物處理，收集細(xì)胞。將其置于含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中，冰上裂解30 min，12000 r/min離心5 min后取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白與5×上樣緩沖液混合，97℃煮沸變性10 min，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，再分別與兔多抗LC3-II和LC3-I （1:1000)、兔單抗Beclin-1（1:2000）4℃孵育過夜，TBST溶液洗滌后和相應(yīng)的二抗（HRP標(biāo)記，1:50000）37℃孵育2 h，ECL顯色，X線壓片曝光30～180 s，掃描膠片，BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采取方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA對高糖條件下HRMEC增殖的影響

各組細(xì)胞增殖率分別為：NC組（99.97±0.88）%、HG組（162.73±0.66）%、LC組（153.13±1.92）%、MC組（147.59±2.00）%、HC組（132.27±0.97）%。5組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=915.843，P=0.000）。與NC組比較，其他4組細(xì)胞增殖率均增加（tHG=-98.465，tLC=-43.633，tMC=-37.679，tHC=-42.703，均P=0.000）；與HG組比較，LC組、MC組、HC組細(xì)胞增殖率均降低（tLC=8.198，P=0.001；tMC=12.427，P=0.000；tHC=44.898，P=0.000）；與LC組比較，MC組、HC組細(xì)胞增殖率降低（tMC=3.461，P=0.026；tHC=16.817，P=0.000）；與MC組比較，HC組細(xì)胞增殖率降低（t=11.921，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。增殖率隨著RA濃度的升高而降低（圖1）。

2.2 RA對高糖條件下HRMEC遷移的影響

圖1 各組HRMEC形態(tài)圖（×100）及增殖能力比較。1A-1E細(xì)胞形態(tài)圖。1A正常對照組；1B高糖組；1C低濃度RA組；1D中濃度RA組；1E高濃度RA組。1F各組細(xì)胞增殖能力比較。NC正常對照組；HG高糖組；LC低濃度RA組；MC中濃度RA組；HC高濃度RA組

各組細(xì)胞遷移數(shù)（個）分別為：NC組（41.00±5.29）、HG組（118.67±2.52）、LC組（78.67±3.06）、MC組（67.33±3.06）、HC組（53.67±4.93）。5組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=171.709，P=0.000）。與NC組比較，其他4組的細(xì)胞遷移數(shù)均增加（tHG=-22.958，P=0.000；tLC=-10.677，P=0.000；tMC=-7.465，P=0.002；tHC=-3.033，P=0.039）；與HG組比較，LC組、MC組、HC組細(xì)胞遷移數(shù)均降低（tLC=17.504，tMC=22.463，tHC=20.330，均P=0.000）；與LC組比較，MC組、HC組細(xì)胞遷移數(shù)降低 （tMC=4.543，P=0.010；tHC=7.463，P=0.002）；與MC組比較，HC組細(xì)胞遷移數(shù)降低（t=4.080，P=0.015），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。遷移數(shù)隨著RA濃度的升高而降低（圖2）。

2.3 RA對高糖條件下HRMEC管腔形成的影響

各組細(xì)胞管腔形成數(shù)（個）分別為：NC組（48.33±2.08）、HG組（95.67±5.51）、LC組（83.33±2.52）、MC組（69.67±2.52）、HC組（58.67±1.53）。5組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=107.829，P=0.000）。與NC組比較，其他4組細(xì)胞管腔形成數(shù)均增加（tHG=-13.924，P=0.000；tLC=-18.562，P=0.000；tMC=-11.314，P=0.000；tHC=-6.932，P=0.002）。與HG組相比，LC組、MC組、HC組細(xì)胞管腔形成數(shù)均降低（tLC=3.528，P=0.024；tMC=7.437，P=0.002；tHC=11.213，P=0.000）；與LC組比較，MC組、HC組細(xì)胞管腔形成數(shù)均降低（tMC=6.651，P=0.003；tHC=14.513，P=0.000）；與MC組比較，HC組細(xì)胞管腔形成數(shù)降低（t=6.472，P=0.003），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。管腔形成數(shù)隨著RA濃度的升高而降低（圖3）。

圖2 各組HRMEC遷移情況（×200）及遷移能力比較。2A-2E細(xì)胞遷移情況。2A正常對照組；2B高糖組；2C低濃度RA組；2D中濃度RA組；2E高濃度RA組。2F各組細(xì)胞遷移能力比較。NC組正常對照組；HG高糖組；LC低濃度RA組；MC中濃度RA組；HC高濃度RA組

圖3 各組HRMEC管腔形成情況（×100）及形成能力比較。3A-3E細(xì)胞管腔形成情況。3A正常對照組；3B高糖組；3C低濃度RA組；3D中濃度RA組；3E高濃度RA組。3F各組細(xì)胞管腔形成能力比較。NC正常對照組；HG高糖組；LC低濃度RA組；MC中濃度RA組；HC高濃度RA組

2.4 RA對高糖條件下HRMEC自噬泡的影響

在透射電鏡下可以觀測到各組HRMEC細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組中細(xì)胞內(nèi)有多個自噬體和（或）自噬溶酶體存在，與NC相比較，HG組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)自噬泡明顯增多，LC、MC和HC組也能找到自噬泡存在，但鏡下自噬泡總體已較HG組減少，且RA濃度越高，自噬泡越少，顯示出RA具有較強(qiáng)的抑制自噬泡形成的作用（圖4）。

2.5 RA對高糖條件下HRMEC自噬蛋白LC3、Beclin-1表達(dá)的影響

各組細(xì)胞LC3-II/LC3-I比值、Beclin-1蛋白表達(dá)依次分別為：NC組 （0.20±0.01）（0.12±0.01）；HG組（0.78±0.01）（0.76±0.01）；LC組（0.51±0.01）（0.54±0.03）；MC組（0.45±0.02）（0.37±0.03）；HC組（0.33±0.02）（0.20±0.02）。

LC3-II/LC3-I比值：5組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=809.942，P=0.000）。與NC組比較，其他4組均增加（tHG=-86.500，P=0.000；tLC=-37.967，P=0.000；tMC=-23.401，P=0.000；tHC=-10.070，P=0.000）；與HG組相比，LC組、MC組、HC組均降低（tLC=40.000，tMC=35.002，tHC=37.165，均P=0.000）；與LC組比較，MC組、HC組均降低（tMC=6.008，P=0.004；tHC=13.943，P=0.000）；與MC組比較，HC組降低（t=8.030，P=0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LC3-II/LC3-I比值隨著RA濃度的升高而降低（圖5A、5B）。

圖4 電鏡下各組HRMEC自噬泡的形成情況（×100）。4A正常對照組；4B高糖組；4C低濃度RA組；4D中濃度RA組；4E高濃度RA組。自噬體（雙層膜）或自噬溶酶體（單層膜）（黃色箭頭）

Beclin-1表達(dá)：5組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=574.808，P=0.000）。與NC組比較，其他4組表達(dá)均增加（tHG=-85.865，P=0.000；tLC=-28.174，P=0.000；tMC=-16.203，P=0.000；tHC=-9.192，P=0.000）。與HG組比較，LC組、MC組、HC組表達(dá)均降低（tLC=13.762，tMC=23.200，tHC=50.051，均P=0.000）；與LC組比較，MC組、HC組表達(dá)均降低（tMC=7.906，P=0.001；tHC=19.612，P=0.000）；與MC組比較，HC組表達(dá)降低（t=9.449，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Beclin-1表達(dá)隨著RA濃度的升高而降低 （圖5A、5C）。

3 討論

圖5 Western blot法檢測各組HRMEC LC3、Beclin-1表達(dá)的比較。5A各組細(xì)胞LC3、Beclin-1的表達(dá)水平；5B各組細(xì)胞LC3-II/LC3-I比值表達(dá)的比較；5C各組細(xì)胞Beclin-1表達(dá)的比較。NC正常對照組；HG高糖組；LC低濃度RA組；MC中濃度RA組；HC高濃度RA組

DR是由糖尿病引起的特征性病變，具有較高的發(fā)病率和致盲率。據(jù)相關(guān)報道，糖尿病病程超過10年的患者出現(xiàn)DR的幾率約為60%，病程超過15年出現(xiàn)DR的幾率約為75%～80%。DR是全球范圍內(nèi)青壯年勞動力人群致盲的首要原因，也是我國主要的致盲眼病之一[11-12]。DR的病理生理特點(diǎn)為視網(wǎng)膜毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性增強(qiáng)、內(nèi)皮細(xì)胞基底膜增厚、周細(xì)胞喪失、毛細(xì)血管閉塞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血、缺氧，刺激促血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）的形成與釋放，從而產(chǎn)生新生血管。病理性新生血管，是由于內(nèi)皮結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，引起血管滲漏，導(dǎo)致或加重視網(wǎng)膜出血、水腫，甚至引起玻璃體積血，積血長期不吸收，在玻璃體腔或視網(wǎng)膜表面形成機(jī)化膜，牽拉視網(wǎng)膜，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的解剖和功能改變，嚴(yán)重危害視功能[13-14]。目前，臨床用于治療DR的方法主要有藥物、激光、玻璃體手術(shù)等，其中藥物和激光治療適用范圍較廣，安全性較高[15]。然而，盡管近年來對于DR的治療已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，但由于DR的病理機(jī)制復(fù)雜，這些治療方法并非對所有患者奏效。因此，仍迫切需要對DR的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行更全面的研究和開發(fā)新的治療策略。

在PDR的發(fā)生發(fā)展中，RNV被認(rèn)為是最重要的環(huán)節(jié)之一。VEGF作為一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子在DR發(fā)病機(jī)制中的作用已得到公認(rèn)，對于PDR和威脅視力的糖尿病黃斑水腫，大量強(qiáng)有力的證據(jù)支持使用玻璃體腔注射抗VEGF藥物進(jìn)行治療[16-17]。然而，玻璃體腔注射抗VEGF藥物存在促進(jìn)PDR患眼視網(wǎng)膜纖維化的風(fēng)險[18]。RA是一些中草藥的主要活性成分，在迷迭香、鼠尾草和紫蘇等植物中廣泛分布。在大力發(fā)展民族醫(yī)藥研究的今天，RA以其抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多方面的藥理作用得到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，其各種藥理學(xué)活性在體內(nèi)相互關(guān)聯(lián)，共同發(fā)揮治療疾病的作用[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA能明顯抑制高糖條件下的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成過程，且抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)，提示RA可能也具有治療PDR的潛能。Kim等[22]在小鼠氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中的研究表明，RA可以顯著抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴性，此外RA還能有效抑制細(xì)胞管腔形成，與本研究結(jié)果一致。另外，利用HRMEC作為觀察對象，也提示RA對DR等增殖性視網(wǎng)膜疾病具有治療潛能。

自噬是近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，它是一種自體的自我吞噬，是細(xì)胞清除受損或多余細(xì)胞器、并能適應(yīng)外界環(huán)境壓力來維持生存的過程。自噬是非常重要的細(xì)胞內(nèi)平衡過程，包括一系列連續(xù)的步驟，這些步驟對于降解和回收細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)是必不可少的。自噬基本上是一種適應(yīng)性反應(yīng)，在應(yīng)激狀態(tài)下保證衰老和受損細(xì)胞器的生理周轉(zhuǎn)，從而通過各種信號通路控制細(xì)胞命運(yùn)[23]。雖然各種代謝紊亂與DR的發(fā)病有關(guān)，但由于這種多因素疾病的復(fù)雜性，任何因素與DR之間的聯(lián)系都是可疑的。大量研究[10,24-26]已證實(shí)，高糖會上調(diào)自噬水平，自噬功能障礙與DR及其RNV的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。電鏡是觀察、檢驗(yàn)自噬現(xiàn)象的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可以觀察到自噬泡的形態(tài)特征，但由于應(yīng)用透射電鏡觀察自噬泡形態(tài)對實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)者的技能與辨別能力要求較高，而且無法直接觀察活細(xì)胞，所以還需與其他檢測方法互相補(bǔ)充，對自噬現(xiàn)象的發(fā)生與改變進(jìn)行總體評價[27]。因此，本研究利用電鏡觀察自噬泡和Western blot檢測自噬關(guān)鍵蛋白兩種方法對細(xì)胞的自噬水平進(jìn)行了研究。哺乳動物L(fēng)C3是最常用的自噬分子標(biāo)記物，具有兩種亞型，LC3-Ⅰ位于胞質(zhì)內(nèi)，LC3-Ⅱ位于自噬體膜。當(dāng)自噬激活時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)生成LC3-Ⅱ，可通過Western blot法檢測LC3-II/LC3-I的表達(dá)水平，以反映自噬體的數(shù)量[28]。Beclin-1是一種其他自噬蛋白基因參與自噬形成過程的必須成分，也常被用作自噬標(biāo)記分子[28]。與既往研究相符，本研究也發(fā)現(xiàn)高糖可以上調(diào)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，表現(xiàn)為自噬泡的增多和自噬標(biāo)記蛋白LC3及Beclin-1的蛋白表達(dá)增強(qiáng)。同時，各濃度RA聯(lián)合高糖處理的細(xì)胞表現(xiàn)出自噬下調(diào)，即與高糖組對比，其細(xì)胞內(nèi)自噬泡減少、LC3及Beclin-1的蛋白表達(dá)減弱。以上研究結(jié)果提示，自噬信號通路在DR的RNV形成中扮演重要角色，RA通過抑制該信號通路抑制RNV的形成。

RA廣泛的藥理作用使其具有巨大的醫(yī)用前景，但RA的部分藥理效應(yīng)仍未完全闡明，有待后期進(jìn)一步的探索。本研究提示抑制自噬信號通路可能是RA抑制高糖條件下視網(wǎng)膜血管形成的機(jī)制之一。然而，體外研究結(jié)果不能完全代表疾病的真實(shí)情況，RA是否能對DR和RNV發(fā)揮治療作用，還需要利用動物疾病模型甚至患者進(jìn)行深入研究。