膜蛋白基因與抗生素環境適應性的關聯研究

張文羿，劉洋碩

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業農村部奶制品加工重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引 言

益生菌是足量攝入后會在人體內定殖并對健康有益的一類活的微生物，它是通過改善和維持腸道微生物平衡來宿主產生有益影響，目前被廣泛應用于食品、醫藥和工業等領域[1]。但是由于益生菌本身的特性，它在定殖于人體腸道之前往往會受到來自環境的脅迫，包括人體胃腸道中內源性物質的脅迫以及加工及貯藏過程的環境考驗。內源性物質主要包括胃酸、膽鹽等；而外界環境的脅迫主要為冷熱脅迫、滲透壓脅迫以及氧脅迫[2-3]。不僅如此，近些年興起的抗生素也成為一種新的脅迫環境。由于抗生素濫用的現象非常普遍，在治療胃腸道或者與感染相關的疾病時尤為嚴重，這會對人體腸道中的腸道菌群產生一定的影響，也會導致益生菌在進入人體之后無法發揮其本身的益生功能。因此，十分有必要研究益生菌在抗生素環境下的適應性機制。

基因敲除技術是根據同源重組的原理，構建帶有同源序列的基因敲除載體，以電轉化或者熱轉化的方式將其導入細胞，取代原始菌株上的等位基因，從而產生缺少目的基因的突變株，通過分析突變株的表型變化以及其與原始菌株的表型差異來確定目的基因的生物學功能，該技術是目前研究基因功能最有效的方法之一[4]。Cre/lox 位點特異性基因重組系統可以對轉入的基因進行組織特異性和定點操作，對選取的目的基因進行整合性刪除和條件性重組，這是基因敲除技術的關鍵組成部分[5]。該系統中主要涉及到的是Cre重組酶，其作用是介導兩個LoxP位點間的重組[6]。

Lactobacillus plantarum P-8 源自自然發酵酸牛乳，具有調節血脂、維持微生態平衡的功能特性[7-9]。課題組前期采用蛋白質學技術建立了L. plantarum P-8 適應氨芐西林環境過程中的差異表達蛋白譜，結果發現膜蛋白基因（LBP_cg0719）與抗生素環境適應性密切相關。與原始菌株相比，膜蛋白基因在氨芐西林環境下適應性進化1600 代后的L. plantarum P-8 菌株中顯著上調控。本研究為了進一步了解膜蛋白基因在L. plantarum P-8 適應氨芐西林環境中作用，采用Cre/lox 基因重組技術對膜蛋白基因的生物學功能進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌株和質粒

在氨芐西林環境下連續培養1600 代的抗生素菌株Lactobacillus plantarum P-8-A-1600[10]，由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室提供；Escherichia coli DH5α[11]購買于澤生生物技術有限公司；質粒pNZ5319[11]和質粒pMSPcre[12]分別由荷蘭瓦格寧根大學和山東大學提供。

（2）所用試劑及配制溶液

高保真 DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、5× PCR Buffer、三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs）和核酸染料均購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶購自美國New England Biolabs 公司；T4 連接酶購自美國Beckman公司；紅霉素和氯霉素購自美國Sigma公司。

溶液I：MRS液體培養基中添加0.75 mmol/L山梨醇和0.1%甘氨酸；溶液II：1 mmol/L蔗糖＋3.5 mmol/L MgCl·26H2O，用于洗滌細胞。復蘇液：MRS+10 mmol/L CaCl2+100 mmol/L MgCl2+0.75 mol/L 山梨醇。以上溶液均需要現配現用，使用之前在冰上預冷。

（3）所用培養基

MRS 培養基，用于 L. plantarum P-8 的增殖，生長條件為37 ℃靜置培養。使用根據需要前添加紅霉素或氯霉素，添加量根據提供的效價計算，需要將其配制成水溶液（濃度均為10 μg/mL）并進行濾菌操作，采用0.22 μm 的水系濾膜進行過濾。

LB 培養基，用于大腸桿菌的增殖，生產條件為37 ℃搖床培養。紅綠霉素的添加方式與MRS培養基一致，紅霉素終濃度為250 μg/mL，氯霉素為10 μg/mL。

（4）所用儀器

PCR 儀，購自美國 Applied Biosystems 公司；核酸電泳儀、UPV 凝膠成像系統和MicroPulser TM 電擊儀，均購自美國Bio-Rad 公司；BT25S 分析天平，購自美國 Merrler Toledo 公司；5417R 離心機，購自德國Eppendorf 公司；DU800 分光光度計，購自美國Beckman公司。

1.2 引物設計

在NCBI數據庫中查找L. plantarum P-8全基因組序列（CP005942.2）并找出 LBP_cg0719 基因序列，使用軟件Primer premier 5.0 設計上下游同源臂引物，大小約為1 000 bp。引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成，具體引物名稱以及序列如表1所示。

表1 引物基本信息

1.3 同源臂擴增

以L. plantarum P-8 基因組DNA 為模板，分別使用LBP_cg0719 的上下游同源臂引物進行PCR 擴增，得到長度約1000 bp 的上下游同源臂片段。PCR 反應的條件為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，共 30 個循環；72 ℃終端延伸10 min；4 ℃保存。PCR 的反應體系為50 μL，各成分及相應體積如表2所示。

表2 PCR反應體系基本信息

1.4 構建敲除載體pNZ5319-0719 Up-Down

用限制性內切酶將同源臂上游片段插入pNZ5319 質粒的 XohI、PemI 酶切位點中，同源臂下游片段插入Eco53kI、BglII 酶切位點中。在42 ℃將質粒pNZ5319 的 DNA 轉入 E.coli DH5α 感受態細胞中，吸取菌體細胞 100 μL 涂布于 10 μg/mL 的氯霉素 LB 固體平板，37 ℃培養48 h，篩選具有氯霉素抗性的載體pNZ5319-0719 Up-Down。用PCR 擴增驗證結果，并將產物寄出測序，反應所用引物為0719 upF/85R 和87F/0719 downR。

1.5 感受態菌體細胞的制備

將抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 活化2 代后接種到MRS 空白培養基中，放置在37 ℃培養箱中培養24 h。將菌液以2%的接種量接種到溶液I 中，37 ℃ 培養至其 OD600值在 0.3～0.6 之間時取出離心（6 000 rpm，4 ℃，5 min），棄掉上清液收集菌體。用1 mL 預冷的溶液II 重懸菌體，以相同條件離心，棄掉上清液收集菌體，重復洗滌3次。最后用40 μL預冷的溶液II重懸菌體，得到的菌液即為感受態菌體細胞。

1.6 敲除載體的電轉化

無菌電轉化杯置于冰上預冷10 min，加入40 μL預冷的感受態菌體細胞和1 μg 質粒DNA，吹打混勻后在冰上靜置10 min。設置電擊儀的使用參數：電容25 μF、電壓1.7 kV、電阻200 Ω。將電轉化杯快速擦干放入電擊槽開始電轉化。務必要確保杯身的干燥潔凈，防止爆杯現象的發生。電轉化后，在電轉化杯中加入960 μL 預冷的復蘇液，吹打混勻，在冰上靜置5 min；之后將菌液轉移至2 mL 無菌EP 管中37 ℃靜置培養3 h，吸取100 μL 菌液涂布到含有氯霉素的MRS平板上，37 ℃培養48 h，長出的菌落即為轉化子。

1.7 篩選雙交換轉化子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71

挑取轉化子單菌落，分別在含氯霉素10 μg/mL的MRS 液體培養基中活化24 h，隨后接種在濃度均為10 μg/mL 紅氯霉素雙抗生素MRS 培養基中，篩選出具有氯霉素抗性且不具有紅霉素抗性的雙交換子，同時將抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 分別接種于含僅氯霉素和僅含紅霉素的MRS 培養基中作為對照組進行培養（紅氯霉素濃度均為10 μg/mL）。將篩選到的雙交換子、敲除載體以及抗生素菌株分別用引物（EryF/EryR、CatF/CatR、0719 upF/0719 downR）進行擴增，驗證結果并寄樣測序。

1.8 消除紅霉素抗性基因并構建突變菌株L.plantarum P-8-A-1600-0719

將具有氯霉素抗性的雙交換子電轉到pMSPcre質粒中，電轉化的過程及條件與上述一致，涂布在10 μg/mL紅霉素的MRS固體平板上，37 ℃培養48 h。長出的菌落則為含有紅霉素抗性的菌株，即帶有pMSPcre 質粒的菌株。將其在MRS 液體培養基中連續傳代使質粒pMSPcre 從菌株中丟失。為了驗證突變株是否構建成功，將篩選到的突變株再次用LBP_cg0719 的同源臂引物進行PCR 擴增驗證，所用引物為EryF/EryR、CatF/CatR和0719 upF/0719 downR，以連續傳代前含有pMSPcre 質粒的菌株作為對照。如果PCR驗證及測序結果均為正確，那么所得到的菌株即為突變菌株L. plantarum P-8-A-1600-0719。

1.9 突變菌株L. plantarum P-8-A-1600-0719 耐藥表型分析

將突變菌株L. plantarum P-8-A-1600-0719 和抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 分別接種在濃度為 4 μg/mL、8 μg/mL 和 16 μg/mL 的氨芐西林 MRS培養基以及不含氨芐西林的空白MRS 培養基中，37 ℃靜置培養48 h，采用分光光度計測定不同菌株在波長為600 nm時的OD值。以抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 的OD600值作為對照，從而分析突變株與抗生素菌株的耐藥性表型。

2 結 果

2.1 敲除載體pNZ5319-0719 Up-Down的構建

在含有10 μg/mL 氯霉素的LB 平板上篩選具有抗性的菌株進行增殖培養，隨后用PCR 反應進行驗證。結果如圖1 所示，泳道1 至泳道4 所用引物分別為 0719upF/0719upR、0719upF/85R、0719downF/0719downR 和 87F/0719downR。泳道 1 與泳道 2 相比，條帶要低100 bp 左右；泳道3 和泳道4 相比，條帶同樣要低100 bp 左右。這是因為85R 的位點本身要比0719upR 靠后100 bp 左右，而87F 的位點要比0719downF 靠前約100 bp，所以導致載體片段大小發生變化，在膠圖中顯示為泳道2 和4 的條帶比泳道1 和3 高約100 bp，由以上結果說明前后臂已經成功插入pNZ5319 質粒，且測序結果說明各序列均正確。由此可知，載體pNZ5319-0719 Up-Down成功構建。

圖1 敲除載體PCR方法驗證

2.2 雙交換子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71的篩選

將敲除載體pNZ5319-0719 Up-Down電擊轉化到L. plantarum P-8-A-1600后，涂布于濃度均為10 μg/mL氯霉素和紅霉素MRS 固體平板上，篩選出具有氯霉素抗性且不具有紅霉素抗性的雙交換子，即前后同源臂均進行交換的帶有質粒的菌株。用引物0719 upF/0719 downR、EryF/EryR、CatF/CatR 進行驗證，并以抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 和質粒pNZ5319 作為對照。泳道1-3 所用引物為EryF/EryR；泳道4-6 所用引物為CatF/CatR；泳道7-9 所用引物為0719 upF/0719 downR。菌株順序依次為抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600、質粒pNZ5319 和雙交換子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71。驗證結果如圖2 所示，因為pNZ5319 同時具有紅霉素基因和氯霉素抗性基因而抗生素菌株和突變株均無紅氯霉素抗性，所以泳道2 出現條帶，而泳道 1 和 3 沒有出現條帶；L. plantarum P-8-A-1600 不含紅霉素基因和氯霉素基因，因此泳道4 沒有出現條帶，而泳道5 和泳道6 均出現條帶。因為抗生素菌株、質粒和突變株均含有LBP_cg0719 目的基因，所以泳道7-9 均有條帶出現，而由于質粒pNZ5319 和雙交換子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71與L. plantarum P-8-A-1600 相比多了氯霉素抗性基因片段，因此其全長片段要大于L. plantarum P-8-A-1600，在膠圖中顯示為泳道7 的條帶要比泳道8 和9 稍低。PCR 產物的測序結果顯示各序列均正確。由此可知，已經成功地篩選到了雙交換子。

表3 PCR所用菌株及引物

圖2 雙交換子PCR方法驗證

2.3 突變株L. plantarum P-8-A-1600-0719的構建

將質粒pMSPcre 電轉到篩選到的雙交換子L. plantarum P-8-A-1600-0719::lox66-P32-cat-lox71中，涂布于濃度為10 μg/mL 紅霉素的MRS 平板上，篩選出具有紅霉素抗性而不具有氯霉素抗性的菌株，并在無抗生素的空白MRS 培養基中連續傳10 代使pMSPcre 質粒丟失。用引物EryF/EryR、CatF/CatR和0719 upF/0719 downR 進行驗證，以L. plantarum P-8-A-1600 和質粒 pMSPcre 作為對照。泳道 1-3 為L. plantarum P-8-A-1600、質粒 pMSPcre 和 L. plantarum P-8-A-1600-0719 用 EryF/EryR 為引物的 PCR產物，泳道4-6 所用引物為CatF/CatR，泳道7-9 是抗生素菌株、質粒和突變株用目的基因特異性引物0719 UpF/0719 DownR 進行PCR 得到的結果。驗證結果如圖3 所示，在L. plantarum P-8-A-1600-0719中均沒有出現紅霉素、氯霉素的基因，且L. plantarum P-8-A-1600中的前后臂比L. plantarum P-8-A-1600-0719 要長500 bp 左右。同時，測序結果也顯示各序列都正確。因此，結果說明已經成功構建了突變株L.plantarum P-8-A-1600-0719。

2.4 突變株L. plantarum P-8-A-1600-0719 的耐藥表型分析

對突變株L. plantarum P-8-A-1600-0719 進行氨芐西林耐藥性表型分析，并且對其在不同氨芐西林濃度中的生長特性進行檢測。以抗生素菌株L. plantarum P-8-A-1600 為對照，結果如圖4 所示，突變株L.plantarum P-8-A-1600-0719 在正常培養基中生長時，和抗生素菌株相比，OD600值幾乎沒有差異。隨著氨芐西林的濃度不斷提高，抗生素菌株和突變株的OD600值同時呈現下降的趨勢，但是兩者之間的差距也在逐漸增加。當氨芐西林濃度增加到16 μg/mL時，突變株的OD600值約為抗生素菌株的2 倍。因此，由L. plantarum P-8-A-1600-0719 的耐藥性表型可以推斷，基因LBP_cg0719 與L. plantarum P-8 抗生素適應性菌株的耐藥性相關。

表4 PCR反應所用菌株及引物

圖3 突變株PCR方法驗證

圖4 抗生素菌株與突變株在添加不同濃度氨芐西林的LSM培養基中濁度的變化

3 結 論

本研究以實驗室抗生素適應性進化性菌株為研究對象，為了進一步確認該基因的生物學功能，采用Cre-lox 基因敲除技術對目的基因LBP_cg0719 進行敲除實驗，得到L. plantarum P-8-A-1600-0719 突變體菌株，并對其表型進行分析。研究結果顯示敲除了LBP_cg0719 基因的突變體菌株在抗生素環境中的濁度更大，生長狀況更加良好，相比于L. plantarum P-8-1600 具有更好的適應性。因此可以推測，LBP_cg0719 基因對L. plantarum P-8的耐藥性具有一定的調節作用。