副干酪乳桿菌和馬克斯克魯維酵母混合發酵條件優化

李晏蝶，李珊，高云云，李寶坤

（石河子大學食品學院畜產實驗室，新疆石河子832000）

0 引 言

微生物互利共生或共生形式的共生現象[1]在發酵食品中廣泛存在，例如在奶酪[2]、酸馬奶[3]或酸面團[4-5]中。嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌的共生關系在酸奶發酵中得到很好的應用[6]。在人為構建的微生物組合中進行研究可以避免環境與微生物群落背景的復雜性[7-8]。

副干酪乳桿菌在乳制品中作為發酵劑及輔助發酵劑大量使用[9]，馬克斯克魯維酵母是一種普遍存在于天然發酵乳制品中的酵母[10]，混合發酵能夠縮短發酵時間[11]、獲得高細胞活性[12]、賦予制品獨特風味[13]及豐富的營養[14]。利用正交實驗優化混合發酵條件，在最優條件下定量幾種主要代謝物及風味物質，為復合發酵劑的開發提供基礎。

1 實 驗

1.1 菌株及試劑

菌株：試驗所用菌株為從馬奶酒中分離出的1 株副干酪乳桿菌SMN-LBK 和1 株馬克斯克魯維酵母SMN-S7-LBK，由石河子大學食品學院乳制品課題組提供。

培養基：YPD 培養基、MRS 培養基、改良CHALMERS 培養基、脫脂乳粉培養基（脫脂乳粉10%、大豆蛋白胨1%、酵母浸粉0.5%、蔗糖0.5%）在115 ℃高壓蒸汽滅菌，pH 自然。

試劑：無水乙醇，天津市富宇精細化工有限公司；酪蛋白，北京奧博星生物技術有限責任公司；結晶紫，天津市天新精細化工開發中心；碘，天津市致遠化學試劑有限公司；丁二酮、鄰苯二胺、L-酪氨酸、溴化鈉、硫脲均由上海麥克林生化科技有限公司提供。

1.2 儀器

全自動新型生化培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；臺式高速冷凍離心機，力康發展有限公司；數顯恒溫水浴鍋，金壇市醫療儀器廠；酶標儀，美國BIOTEK 儀器有限公司等。

2 方 法

2.1 菌種的活化

將1 株副干酪乳桿菌與馬克斯克魯維酵母菌分別接種于MRS 培養基在37 ℃下培養16 h 和YPD 培養基中在28 ℃下培養24 h，傳代至3代備用。

2.2 生長性能

2.2.1 生長曲線

采用比濁法測定菌株的生長曲線。活化后的乳酸菌、酵母菌以2% 1∶1 的接種量接種于裝有150 mL液體培養基的250 mL 錐形瓶中，在32 ℃條件下培養30 h，以2%接種量37 ℃純培養乳酸菌、28 ℃培養酵母菌為對照，每隔3 h 測定OD600值，繪制OD600值與培養時間的曲線。

2.2.2 活菌數的測定

混合培養使用脫脂乳培養基。將發酵液梯度稀釋，選取3 個梯度做3 個重復進行平板菌落計數。單菌培養乳酸菌活菌計數采用MRS 瓊脂培養基，單菌培養酵母菌計數采用YPD 瓊脂培養基。混菌培養計數乳酸菌選擇改良CHALMERS 培養基，混菌培養計數酵母菌使用添加100 mg/L 氯霉素的YPD 固體培養基。計數乳酸菌平板于37 ℃恒溫培養箱倒置培養36 h 開始計數，計數酵母菌平板于28 ℃培養48 h 后計數。觀察這兩株菌是否會在混合培養中顯示出與單菌培養顯著不同的生長情況，判斷這2 株菌間是否存在共生現象，用以建立互作組合。

2.3 條件優化

單因素及其梯度的選擇如表1 所示，并根據單因素試驗結果設計混合發酵優化條件。

2.4 理化指標

在混合發酵最優條件下測定發酵液pH 值、滴定酸度、酒精體積分數、蛋白酶活、生物膜、檸檬酸、丁二酮、乙醛體積分數，和單菌培養進行對比。

pH 值的測定參考GB 5009.239-2016 pH 計法。

滴定酸度的測定使用酚酞指示劑法[15]。

丁二酮的測定使用鄰苯二胺比色法[18]測定丁二酮。

乙醛的測定選用碘滴定法[19]測定乙醛。

2.4.1 酒精體積分數的測定

采用重鉻酸鉀比色法，取2.5 mL 無水乙醇，加入到100 mL 的容量瓶中，定容成乙醇標準溶液，分別取0、1、2、3、4、5、6、7 mL 乙醇標準溶液于25 mL 比色管中定容，各取出2.5 mL 加入試管，依次加入5 mL 2.0%的重鉻酸鉀溶液和2.5 mL 98%的濃硫酸混勻，錫箔紙封口，反應10 min，搖勻冷卻至室溫，以乙醇濃度為零處理標樣作為空白，在610 nm 波長下測定各個處理樣的吸光度，繪制乙醇標準曲線。發酵液4 000 r/min離心后取出上清液10 倍稀釋，處理同上測定OD610，帶入標曲計算酒精含量，再根據稀釋倍數得到最終發酵液酒精濃度。

2.4.2 蛋白酶活的測定

參考GB/T 23527-2009，制作酪氨酸溶液標準曲線，酪蛋白溶液于40 ℃水浴預熱5 min，將發酵液離心上清液10 倍稀釋，分別取1 mL 加入試管，在40 ℃水浴中預熱2 min，加入1 mL酪蛋白溶液，保溫10 min，加入0.4 mol/L 三氯乙酸2 mL，使反應終止，蛋白沉淀后離心過濾，取濾液測OD275，帶入標曲求出樣品稀釋液酶活力，單位u/mL，考慮稀釋倍數最終得到樣品酶活。

2.4.3 生物膜的測定

選用結晶紫染色法[16]。將 200 μL 菌液加入 96 孔板，調整菌液終濃度為107CFU/mL，用封口膜密封后于30 ℃培養24 h；將板內菌液吸棄，250 μL 生理鹽水洗2 遍，每次洗菌完成后吸棄；加入200 μL 99%甲醇固定15 min，吸棄甲醇，室溫干燥；加入200 μL 2%結晶紫溶液染色5 min，吸棄結晶紫染液，生理鹽水洗2遍，室溫干燥；加入220 μL 33%乙酸溶解混勻；酶標儀檢測OD570值。每個樣本做3個重復。

2.4.4 檸檬酸的測定

選取五溴丙酮法排除雜酸干擾[17]，將發酵液的離心上清液稀釋100倍，取1 mL稀釋液加入比色管，加入1 mL 10%HPO3冰浴1 min，再加入2 mL KMnO4-NaBr溶液冰浴10 min，然后滴加3%H2O2至褪色，加入1.5 mL 正庚烷充分振蕩，靜置分層后取1 mL 上層有機相加入3.5 mL 硼酸鈉-硫脲試劑充分混勻，靜置分層后取下層溶液于445 nm 測定吸光值，1 mL 正庚烷加3.5 mL 硼酸鈉-硫脲試劑渦旋后取下層無機相作為空白對照，代入檸檬酸標準曲線得到稀釋液檸檬酸含量，考慮稀釋倍數得到最終濃度，結果取3 次重復的平均值。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗

由于菌株的最適生長溫度、生長周期不同，且菌的接種量與接種比例直接影響乳酸菌和酵母菌互作，所以選擇發酵溫度、發酵時間、接種量、接種比例四個因素進行單因素試驗，為正交試驗選擇因素水平。

3.1.1 發酵溫度對混合培養活菌數的影響

在酵母菌和乳酸菌最適生長溫度間設計混合發酵溫度梯度，分別計數不同溫度下混合發酵的乳酸菌及酵母菌活菌數。

圖1 單菌培養和共培養生長曲線

圖2 發酵溫度對混合培養活菌數的影響

如圖2 所示，隨著溫度逐漸升高至乳酸菌的最適生長溫度，其活菌數不斷增加，酵母則隨著溫度升高遠離酵母生長最適溫度而活菌數大致呈現減少趨勢。在32 和34 ℃下混合發酵乳酸菌與酵母菌活菌數都比較高，可用于互作現象觀察的培養溫度。對不同發酵溫度下活菌數進行單因素方差分析結果差異不顯著。

3.1.2 接種量對混合發酵的影響

選擇適宜的接種量范圍設計混合發酵接種量梯度，分別計數不同接種量下混合發酵的乳酸菌及酵母菌活菌數，如圖3所示。

圖3 接種量對混合發酵的影響

由圖3 可以看出，乳酸菌隨著混合發酵接種量的增大活菌數先增加后減少，接種量越多，乳酸菌因群體感應能更快的適應環境快速的生長，但當接種量大到一定程度，乳酸菌間會因為競爭營養和生存空間導致乳酸菌的活菌數反而下降[20]。酵母活菌數隨著接種量的增加反而減少，在所選的接種量范圍內一開始就表現出對生長環境的競爭。乳酸菌在較大接種量下活菌數依然較大，可能是由于酵母代謝物為乳酸菌的生長提供營養起到促進作用，而乳酸菌對酵母的促進作用有限反而更容易表現出對生長環境的競爭導致酵母活菌數下降。

3.1.3 接種比例對混合發酵的影響

分別計數不同接種比例下混合發酵的乳酸菌及酵母菌活菌數，結果如圖4所示。

圖4 接種比例對混合發酵的影響

圖4 中，當接種比例為1∶2 時，乳酸菌的活菌數較低，酵母菌活菌數較高，酵母菌的接種量多則能夠快速適應環境進入生長；當接種比例為2∶1 時，乳酸菌接種量較多利于活菌數增長，酵母菌需要更長的時間適應環境而活菌數較少；在接種比例為1∶1 時，乳酸菌和酵母的都具有最高的活菌數，共生促進生長作用大于起始菌數的影響，此接種比例對于混合發酵較為合適。

3.1.4 發酵時間對混合發酵的影響

2 株菌進入對數末期時間大致相同，為積累混合發酵代謝產物，從24 h 開始分別計數不同發酵時間下混合發酵的乳酸菌及酵母菌活菌數，結果如圖5所示。

圖5 發酵時間對混合發酵的影響

圖5 中，酵母的生長周期長于乳酸菌，乳酸菌單獨培養12 h 就能達到穩定期，而酵母菌24 h 活菌數才能達到最大，混合發酵后進行代謝物檢測，需要適當延長混合發酵時間確保同時達到乳酸菌和酵母生長的穩定期。所以混合發酵計數乳酸菌發酵時間選擇為24 h，混合發酵計數酵母菌發酵時間為36 h 較為合適。乳酸菌單獨培養到24 h 大致進入衰亡期，但由于添加了酵母混合發酵，乳酸菌的衰亡期推后，能與酵母菌同時達到較高的活菌數[21]。

3.2 正交實驗

根據單因素實驗結果，選擇接種量、接種比例、發酵時間3 個因素設計3 因素3 水平正交試驗優化混合發酵條件，由于酵母極顯著促進乳酸菌生長，所以將乳酸菌活菌數作為Y 值，期望混合發酵乳酸菌的活菌數達到最大，利于從營養代謝角度考察酵母菌對乳酸菌的促進作用。

表2 混合發酵條件優化結果

根據表2 混合發酵優化結果進行多元線性回歸分析，得到接種量（A）、接種比例（B）、發酵時間（C）對混合發酵中乳酸菌活菌數的回歸方程為：Y=5.87778-0.777778A1+0.455556A2-0.577778B1-0.511111B2-0.0777778C1-1.077778C2。相關系數R=0.98084，決定系數R2=0.96204；調整相關系數R=0.92095，調整決定系數R2=0.84816。表明該多元回歸模型能較好的擬合試驗中Y 值的變化，進而預測混合發酵中乳酸菌活菌數變化。

表3 正交實驗方差分析

根據表3，混合發酵中影響因素的重要性排序為C＞B＞A。比較9 次因素的不同水平組合，混合發酵計數乳酸菌最優條件組合為A3B2C1，乳酸菌活菌數達到7.5×108CFU/mL，對應的混合發酵條件：接種量為5%，乳酸菌與酵母1∶1 混合發酵24 h。正交實驗最優組合應為A2B2C3，進行驗證，最優條件最終確定為混合發酵以4%的接種量，1∶1比例接種，發酵時長28 h。混合發酵使乳酸菌活菌數較高且使衰亡期的到來延滯。

在脫脂乳培養基中對副干酪乳桿菌和馬克斯克魯維酵母進行混合發酵，將MRS 培養基單菌培養乳酸菌和YPD 培養基單菌培養酵母當作對照，馬克斯克魯維酵母對副干酪乳桿菌的促進作用顯著，活菌數（對數值）從7.88 CFU/mL 增長到8.87 CFU/mL；副干酪乳桿菌對馬克斯克魯維酵母促進作用不顯著，活菌數從7.33 CFU/mL增加為7.42 CFU/mL。

3.3 理化指標

對各項理化指標的檢測及差異顯著性分析如表4所示。

表4 理化指標測定結果

脫脂乳培養基中碳源主要為乳糖，乳糖代謝產生乳酸，乳酸能夠影響發酵液酸度變化。乳酸的產生通過糖酵解途徑，葡萄糖在不需氧的條件下在乳酸菌細胞胞漿內分解成丙酮酸進而被還原成乳酸。乳酸菌與酵母混合發酵，將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖的β-半乳糖苷酶和將丙酮酸轉化為乳酸的乳酸脫氫酶活性提高，糖酵解途徑關鍵限速酶——HK 和PK 活力增加，乳酸含量會增加[22]。混合發酵測得pH 值高于單菌培養乳酸菌，可能是由于產生的乳酸與乙醇生成乳酸乙酯，從而使乳酸含量下降，pH 值上升[23]。

乳酸菌與酵母混合發酵中酒精含量高于酵母單菌培養，可能是由于混合發酵中乳酸菌為酵母提供較YPD 培養基更為豐富的碳源利于酵母產酒精。副干酪乳桿菌SMN-LBK 除了生成乳酸外還能生成乙醇等物質，是異型乳酸發酵，但耐乙醇力低于酵母，底物范圍窄。發酵過程中添加酵母菌能夠促進發酵乳中牛血清蛋白、α-酪蛋白、β-乳清蛋白降解[24]。盡管副干酪乳桿菌SMN-LBK 自身產蛋白酶，馬克斯克魯維酵母的高酶活會為其提供更為豐富的氮源，利于乳酸菌生長。混合發酵對副干酪乳桿菌生物膜形成有促進作用，對馬克斯克魯維酵母生物膜形成影響不大。混合發酵中檸檬酸、丁二酮、乙醛含量均高于單菌發酵，有助于改善發酵乳制品的風味[25]。

副干酪乳桿菌和馬克斯克魯維酵母的互作組合構建，從碳源、氮源代謝的角度為其他互作組合的選擇提供依據，副干酪乳桿菌SMN-LBK 具有良好蛋白酶活性，不依賴酵母提供氮源，屬于異型乳酸發酵，可以產生乙醇，既可以產生檸檬酸又可以代謝檸檬酸；而馬克斯克魯維酵母SMN-S7-LBK 能夠發酵乳糖，不依賴乳酸菌分解乳糖產生可利用碳源，并具有高蛋白酶活。這2株菌間存在著代謝物的相互利用關系。

4 結 論

混合發酵提高乳酸菌活菌數的最優條件為：接種量4%，接種比例1∶1，發酵時間28 h。混合發酵中酵母對乳酸菌生長表現出極顯著的促進作用，使乳酸菌活菌數（對數值）從7.88 CFU/mL增加至8.87 CFU/mL，乳酸菌對酵母的促進作用則不顯著。混合發酵酸度低于乳酸菌單菌發酵，混合發酵的蛋白酶活提高，酒精、檸檬酸、丁二酮、乙醛含量增加，能夠促進乳酸菌生物膜形成。這對馬克斯克魯維酵母和副干酪乳桿菌間可以建立微生物共生模型，具有制作復合發酵劑的潛力。馬克斯克魯維酵母SMN-S7-LBK 對碳源利用更為廣泛，它是否可以解除葡萄糖抑制效應，優先利用半乳糖，同時也能利用葡萄糖，以實現既不影響自身生長還能利于乳酸菌增長[26]，這也是此類互作組合模型未來的一個研究方向。