抑制酸奶后發酵桑葉活性成分篩選及桑葉黃酮酸奶工藝

成少寧 ，王芬 ，喬冬 ，董文賓 ，2，黃健 ，3

（1.運城職業技術大學，山西運城044000；2.陜西科技大學，西安710021；3.運城學院，山西運城044000）

0 引 言

桑葉是桑樹的干燥葉，富含多種人體所需的營養物質和生物活性物質，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化等多種功效[1]，《本草綱目》記載“桑之功最神，在人資用尤多”[2]。現代醫學研究表明，桑葉可以改善肥胖[3]，其含有的活性物質都具有降血糖成分[4]，是開發保健食品、功能食品乃至藥品的良好材料來源。

酸奶是人們非常喜愛的食品之一，而在運輸、售賣及貯藏的過程中，很難做到冷藏，導致貯藏后期酸奶的酸度過高，口感不佳，桑葉粉對后發酵具有一定的抑制作用[5]，本研究主要篩選對抑制酸奶后發酵影響最大的桑葉活性成分，并優化桑葉活性成分酸奶工藝，為桑葉的深加工乃至桑葉相關功能性食品的開發提供理論依據。

1 實 驗

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

桑葉多糖、桑葉總黃酮、桑葉生物堿，實驗室提取并保存；鮮牛奶，南山牧場；白砂糖，市售；德式乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌，本學院微生物實驗室；大豆蛋白胨、蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限公司；氫氧化鈉（分析純），廣州光華公司。

1.1.2 儀器設備

GNP-9160 隔水式電熱恒溫培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；GYB40-10S 高壓均質機，上海東華試驗儀器設備有限公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；1/10000g 220gCPA224S 電子分析天平，德國賽多利斯有限公司；DHG-9203A 電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；PB-10pH 計，德國賽多利斯有限公司；TGL-16G 高速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 抑制酸奶后發酵桑葉活性成分篩選

1.2.1.1 酸奶制作流程與操作要點：

鮮牛乳檢驗：鮮牛乳要求色澤乳白、無異物、無凝塊、具有鮮乳固有的香味，經過無菌紗布過濾除雜，按照GB 19301-2010《食品安全國家標準生乳》要求的方法檢驗其蛋白質、脂肪、雜質度、非脂乳固體、微生物等指標，檢驗結果均符合國標要求的鮮牛乳作為酸奶發酵的原料乳。

均質、殺菌：鮮牛乳、7%白砂糖、0.4%桑葉活性物質，混合均勻后在均質機中60 ℃、20 MPa均質5 min。

殺菌：90～95 ℃殺菌10 min。

菌種活化：分別將實驗室中保存的德式乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌試管菌種接種于10%的無菌脫脂乳培養基中42 ℃培養并反復活化，直到活力達到規定要求為止。

冷卻、接種：殺菌后將牛乳快速冷卻至42～45 ℃，加入活化后的菌種，混勻。

發酵、冷藏后熟：42 ℃發酵4 h，待酸牛乳冷卻至室溫后，放入4 ℃的冰箱中后熟24 h，即為酸牛乳成品。1.2.1.2 酸度測定

參照 GB 5009.239-2016 中的第二法 pH 計法[6]對三種活性成分酸奶和對照酸奶貯藏1，5，9，13，17，21 d的酸度進行測定。精確稱取10 g 攪拌均勻的酸奶，置于150 mL 錐形瓶中，加入20 mL 蒸餾水，用0.1 moL/L的氫氧化鈉標準溶液滴定至溶液pH 值穩定在8.30±0.01 處4～5 s，并在這一過程中始終用磁力攪拌器進行攪拌。記錄消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，按照公式計算其滴定酸度。

1.2.1.3 pH 值

用 pH 計檢測貯藏 1，5，9，13，17，21 d 的3 種活性成分酸奶和對照酸奶。

1.2.1.4 持水力

采用重量法[7]，取20 mL 的干燥空離心管質量計為W1，分別向其中加入10 g 左右酸奶，精確稱量質量計為W2，轉速4 000 r/min 離心10 min，小心吸出上清液，精確稱量后計為W3，持水力為=

1.2.1.5 乳酸菌總數測定

按照GB 4789.35-2016 方法[8]分別計數嗜熱鏈球菌數和乳桿菌數，兩者之和即為乳酸菌總數。

1.2.2 最佳發酵工藝條件的確定

以發酵劑接種量、蔗糖添加量、活性成分添加量以及果膠添加量4 個因素進行單因素試驗，確定每個因素發酵的水平，通過響應面進行優化[9]，確定活性成分酸奶的最佳發酵工藝條件。

1.2.2.1 感官評價

抽選食品專業經過培訓的10 名學生，對各酸奶進行組織狀態、色澤、口感、風味的評價和打分，滿分100分，評分標準如表1所示。

表1 酸奶感官評分標準

2 結果與分析

2.1 抑制后發酵桑葉活性成分篩選

2.1.1 桑葉活性成分對酸奶貯藏期酸度的影響

桑葉3 種活性成分對酸奶貯藏期酸度的影響如圖1所示。

圖1 桑葉活性成分對酸奶貯藏期酸度的影響

由圖1 可知，桑葉活性成分酸奶滴定酸度在貯藏前期1～9 d 均隨著貯藏天數的增加而增加，但是在貯藏后期13～21 d 隨著貯藏天數增加滴定酸度減小，而且在貯藏期3 種活性成分中桑葉生物堿的滴定酸度最高，桑葉黃酮最低，說明桑葉生物堿能促進桑葉酸奶的發酵，桑葉多糖和黃酮在初期能促進發酵，但是后期可能會抑制發酵，導致滴定酸度降低，桑葉黃酮抑制酸奶后發酵的作用較其他兩種活性成分強，對照酸奶的滴定酸度在貯藏期均呈增加趨勢。

2.1.2 桑葉活性成分對酸奶貯藏期pH 值的影響

桑葉活性成分對酸奶貯藏期pH 值的影響如圖2所示。

由圖2可知，活性成分酸奶的pH 值貯藏前期都隨著貯藏天數的增加而減小，貯藏后期則有緩慢的上升，其中桑葉生物堿的pH 值最小，桑葉黃酮在貯藏初期（1～5 d）pH 值小于桑葉多糖，但是后期（9～21 d）pH值大于桑葉多糖，對照酸奶的pH 值則隨著貯藏天數的增加呈下降趨勢。pH 值的變化趨勢與滴定酸度基本相同，都為桑葉黃酮的抑制發酵作用最強。

2.1.3 桑葉活性成分對酸奶貯藏期持水力的影響

桑葉活性成分對酸奶貯藏期持水力的影響如圖3所示。

圖3 桑葉活性成分對酸奶貯藏期持水力的影響

由圖3 可知，桑葉在貯藏期持水力基本都呈下降趨勢，持水力反映了酸奶的組織狀態，說明酸奶隨著貯藏天數的增加其組織狀態會變差，會有更多的乳清析出。桑葉生物堿的持水力最大，桑葉黃酮次之。

2.1.4 桑葉活性成分對酸奶貯藏期乳酸菌總數的影響

桑葉活性成分對酸奶貯藏期乳酸菌總數的影響如圖4所示。

圖4 桑葉活性成分對酸奶貯藏期乳酸菌總數的影響

由圖4 可知，3 種活性成分酸奶的乳酸菌數都高于對照酸奶，說明桑葉活性成分均能促進酸奶中乳酸菌數的增值，并且均呈現先升高后降低的趨勢，其中桑葉生物堿酸奶的乳酸菌數最高，并且在貯藏17 d 時達到最高，之后又迅速下降，桑葉多糖的乳酸菌數和桑葉黃酮的乳酸菌數數量和變化趨勢都相近，但是桑葉多糖的乳酸菌數在第13 d 達到最大，桑葉黃酮的乳酸菌數在第17 d達到最大。其中的機理還需進一步研究。

綜合以上檢測結果，桑葉黃酮酸奶在3 種活性成分酸奶中的滴定酸度最低，pH 值在貯藏后期最高，持水力和乳酸菌數雖然都小于生物堿，但是生物堿由于其滴定酸度太高，對酸奶后發酵不能起到抑制作用，所以桑葉黃酮是3 種活性成分中對酸奶后發酵抑制作用最大的活性成分。

2.2 最佳發酵工藝條件的確定

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 發酵劑添加量對桑葉黃酮酸奶發酵的影響

在蔗糖添加量為7%，桑葉黃酮添加量為0.5%，果膠添加量為0.2%，發酵劑添加量分別按照1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%在42 ℃恒溫條件下發酵4 h，然后測定其滴定酸度和感官，結果如圖5所示。

圖5 發酵劑接種量對酸奶發酵的影響

由圖5 可知，酸奶酸度隨著發酵劑接種量的增加呈上升趨勢，說明發酵劑接種量越多，發酵的速度越快，但是感官評分在發酵劑接種量為2.00%時最高，發酵劑接種量大于2.00%時，酸度太高，感官評分下降。

在發酵劑添加量為2.0%，桑葉黃酮添加量為0.5%，果膠添加量為0.2%，蔗糖添加量分別按照3%，5%，7%，9%，11%在42 ℃恒溫條件下發酵4 h，然后測定其滴定酸度和感官，結果如圖6所示。

圖6 蔗糖添加量對酸奶發酵的影響

由圖6 可知，酸奶酸度隨著蔗糖添加量的增加而增加，說明蔗糖可以促進酸奶的發酵，因為蔗糖可以作為乳酸菌的碳源促進乳酸菌的生長從而有助于酸奶酸度的增加，而感官評分在蔗糖添加量9%時最高，添加量大于9%酸度過高，酸甜不協調，感官評分下降。

2.2.1.3 桑葉黃酮添加量對桑葉黃酮酸奶發酵的影響

在蔗糖添加量為7%，發酵劑添加量為2.0%，果膠添加量為0.2%，桑葉黃酮添加量分別按照0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%在42 ℃恒溫條件下發酵4 h，然后測定其滴定酸度和感官，結果如圖7所示。

圖7 桑葉黃酮添加量對酸奶發酵的影響

由圖7 可知，酸奶的滴定酸度和感官評分都隨著桑葉黃酮添加量的增加而呈現先增加后降低的趨勢，黃酮在低濃度時會促進酸奶發酵，但是高濃度的黃酮可能會抑制酸奶的發酵，導致酸奶的滴定酸度下降，添加量在0.70%時都達到最大值。

2.2.1.4 果膠添加量對桑葉黃酮酸奶發酵的影響

在蔗糖添加量為7%，發酵劑添加量為2.0%，桑葉黃酮添加量為0.5%，果膠添加量分別按照0.1%，0.15%，0.2%，0.25%，0.3%在42 ℃恒溫條件下發酵4 h，然后測定其滴定酸度和感官，結果如圖8所示。

圖8 果膠添加量對酸奶發酵的影響

由圖8 可知，果膠添加量對酸奶發酵的影響較小，隨著果膠添加量的增加，酸奶的酸度變化影響較小，但是感官影響較大，因為果膠會影響酸奶的組織狀態，添加量低時，攪拌后酸奶組織較稀薄，添加量太高，酸奶又太稠，添加量0.2%時感官評分最高。

讀楊鵬筆下的故事，你會發現，他的絕大部分作品承載的是一個小小男孩的英雄夢想。楊鵬自己也說，他作品的主人公都有自己的影子，他在心靈深處的某一個角落，永遠是一個14歲的孩子，從未長大。

2.2.2 響應面法優化桑葉黃酮發酵工藝條件

2.2.2.1 響應面實驗設計及結果

根據單因素實驗的結果，運用Box-Behnken 實驗設計原理，選取發酵劑添加量（A）、蔗糖添加量（B）、桑葉黃酮添加量（C）、果膠添加量（D）為影響因素，以感官評分為評價指標，進行4 因素3 水平的響應面分析。試驗結果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果 %

利用Design-Expert V8.0.6 軟件，對試驗結果進行多元二次擬合分析，以及方差分析結果如表3所示。

對實驗數據進行多元二次回歸擬合，得到回歸模型方程為

Y=92.10+0.83A+0.73B-1.34C+0.058D+0.40AB+0.13AC-0.63AD+0.25BC-0.050BD-0.30CD-2.32A2-1.29B2-3.95C2-2.05D2。

由表3 可知，該模型具有極顯著性（P＜0.01），說明響應面模型極度顯著，具有統計學意義，同時失擬誤差為0.8969（P＞0.05）不顯著，其多元相關系數為R2=0.9120，表明所建立的回歸模型的擬合度為91.20%；說明該模型預測值與實際試驗值擬合較好，可以將該模型用于桑葉黃酮酸奶的工藝研究。

由表3 可以看出，各試驗因素對桑葉黃酮酸奶品質的影響排序為桑葉黃酮添加量（C）＞發酵劑添加量（A）＞蔗糖添加量（B）＞果膠添加量（D）。

2.2.2.2 響應面分析討論

利用響應面Design-Expert V8.0.6 軟件處理的交互作用結果見圖9～圖11所示。

圖9 桑葉黃酮添加量與發酵劑添加量交互作用響應面

圖10 果膠添加量與發酵劑添加量交互作用響應面

圖11 桑葉黃酮添加量與果膠添加量交互作用響應面

通過響應面分析可知，對活性成分酸奶感官評價影響最大的交互作用是因素A 和因素D，即發酵劑添加量和果膠添加量，其響應面如圖10 所示。當果膠添加量為0.18%～0.23%，發酵劑添加量為1.7%～2.3%時，響應面值接近最高點，說明在這個范圍內，活性成分酸奶的感官品質較好。

通過Design-Expert V8.0.6 軟件分析得出其最佳的工藝條件為：發酵劑添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑葉黃酮添加量0.67%，果膠添加量0.20%，在此條件下感官評分預測值為92.3994。

根據預測的最佳工藝條件，即發酵劑添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑葉黃酮添加量0.67%，果膠添加量0.20%，進行桑葉黃酮發酵酸奶工藝的驗證實驗，得到其感官評分為91.6，與預測值較接近，說明利用響應面優化得到的工藝條件可行。

3 結 論

（1）試驗通過測定桑葉3 種活性物質酸奶在貯藏期的滴定酸度、pH 值、持水力和乳酸菌數的變化來篩選對酸奶后發酵具有抑制作用的物質，結果顯示桑葉多糖和桑葉黃酮對酸奶后發酵都具有抑制作用，桑葉黃酮的抑制作用最強，桑葉生物堿對酸奶后發酵沒有抑制作用。

（2）采用Box-Behnken 響應面優化的方法，以感官評價為指標，優化得到桑葉黃酮酸奶的最佳發酵工藝為：發酵劑添加量2.10%，蔗糖添加量9.60%，桑葉黃酮添加量0.67%，果膠添加量0.20%。以此工藝和配方，生產桑葉黃酮酸奶，其感官評價分數預測最大值為92.3994，實測值為91.6，生產的桑葉黃酮酸奶色澤微黃，表面有細膩均勻光澤，無沉淀分層，有少量的乳清析出，入口有濃郁的桑葉清香，并且與乳香柔和，酸甜適口。