抗植物軟腐病枯草芽孢桿菌的高密度發酵優化

任玉文 任媛媛 劉雅禎 盧天華 劉力強 周曉輝

摘 要：為提高菌體產量，以益生菌枯草芽孢桿菌Asr作為發酵菌株，采用正交試驗法和響應面法，對枯草芽孢桿菌Asr的發酵工藝進行了優化研究。結果表明，影響菌體產量最主要的3個因素為酵母浸粉、MgSO4和CaCl2;最佳發酵培養基配方為蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉8.65 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L;最佳培養條件為溫度37 ℃、初始pH值7.0、接種量10%、攪拌轉速250 r/min;應用優化配方及工藝，枯草芽孢桿菌Asr的最高產量達到7.30×108 cfu/mL，菌體產量較優化前提高了3.95倍。研究結果可為后續菌體發酵罐的擴大培養提供技術支撐，對其他枯草芽孢桿菌發酵培養基的優化研究提供借鑒。

關鍵詞：發酵工程;枯草芽孢桿菌;發酵工藝;正交法;響應面法;優化

中圖分類號：TS2021 ? 文獻標識碼：A ? doi：10.7535/hbkd.2020yx05007

Abstract：In order to increase yield，take the Bacillus subtilis Asr as the expreession strain， the fermentation process of Bacillus subtilis Asr was optimized by orthogonal test and response surface method. The results show that three main factors affecting bacterial yield are leaching yeast powder， MgSO4 and CaCl2. The best fermentation medium formulation is as following： sucrose 20 g/L， peptone 10 g/L， leaching yeast powder 8.65 g/L， K2HPO4 3.0 g/L， MgSO4 0.27 g/L and CaCl2 0.53 g/L. The optimal culture conditions are as following： 37 ℃， initial pH 7.0， inoculum of 10% and stirring speed of 250 r/min. After the optimization， the highest yield of Bacillus subtilis Asr reaches 7.30×108 cfu/mL， which is 3.95 times higher than that before optimization. The study provides a technical reference for the subsequent bacterial scale-up culture in fermentor and the optimization of fermentation medium from other Bacillus subtilis.

Keywords：fermentation engineering; Bacillus subtilis; fermentation process; orthogonal method; response surface method; optimization

植物軟腐病是由果膠桿菌屬細菌引起的植物病害，侵染植物組織或器官，對中國農業生產造成了巨大危害[1]，近年來由植物軟腐病造成的農業損失數不勝數。如廣東省的香蕉軟腐病，最高發病率可達50%[2];北京通州地區2.5×107 m2的芹菜軟腐病，使植株整體腐爛死亡，造成絕產[3];河北暴發的黃瓜軟腐病，區域發病率最高可達到50%，產量損失嚴重[4]。目前對植物軟腐病的防治方法有合理輪作、避免機械損傷、噴灑農藥或植物水提液[5-8]等，這些方法不僅增加了人力消耗，還會造成環境污染、危害人體健康。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtlis）系芽孢桿菌屬的一種，廣泛分布于土壤及腐敗的有機物中，適宜在枯草浸泡液中繁殖[9-12]。枯草芽孢桿菌是一種優良的生防菌和食品級益生菌[13-14]，具有很強的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等酶活性，代謝旺盛，對人畜無害，不污染環境，在食品、飼料和農業方面應用廣泛[15-17]。在其生長過程中分泌細菌素、脂肽類化合物、有機酸類物質等，可有效抑制病原菌的生長或溶解病原菌[18]，因此在天然食品防腐和田間防治等方面[19]具有十分重要的意義。

在食品研究領域中，可通過優化發酵培養基提高枯草芽孢桿菌野生型菌株產酶或抗菌肽的能力[20-24]。本研究所用的枯草芽孢桿菌Asr，能夠表達CpxP蛋白。經實驗室前期研究發現，CpxP蛋白對含有軟腐病胡蘿卜的抑菌率達到44.89%，對馬鈴薯切片的抑菌率達到59.41%[25]。枯草芽孢桿菌Asr是將益生菌和抗菌蛋白進行協同作用，代替化學農藥，有效抑制植物軟腐病的發生，符合“健康食品、綠色食品”的生活理念。

目前有關枯草芽孢桿菌發酵培養基優化的研究有很多[26-27]。用這些培養基發酵枯草芽孢桿菌Asr，菌體產量偏低，最高產量僅為1.85×108 cfu/mL。本文以枯草芽孢桿菌Asr作為發酵菌株，通過對既定的發酵培養基進行正交試驗和響應面試驗，以OD600值作為最終響應結果，確定最佳發酵培養基配方。基于最佳發酵培養基配方，在3 L小型發酵罐中通過單因素試驗探究最佳發酵溫度、初始pH值、接種量及攪拌轉速，進一步優化發酵工藝，以提高發酵液中的菌體密度，為其應用于食品業提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Asr：河北科技大學蛋白質工程實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑及儀器

蔗糖：天津市百世化工有限公司;蛋白胨、酵母浸粉：北京市奧博星生物技術有限責任公司;磷酸氫二鉀（K2HPO4）：天津市鼎盛鑫化工有限公司;氯化鈉（NaCl）：天津市永晟精細化工有限公司;硫酸鎂（MgSO4）：天津市河東區紅巖試劑廠。

電子天平T1000：常熟市雙杰測試儀器廠;分析天平ME104/02：梅特勒-托利多（上海）有限公司;電子pH計STARTER3100/F：奧豪斯（上海）有限公司;磁力攪拌器HJ-4AS：江蘇省金壇市榮華儀器公司;移液器：大龍醫療設備有限公司;冰箱BCD-189WDPV：海爾公司;超低溫冷凍儲存箱DW-HL100：中科美菱低溫科技有限責任公司;單人單面垂直凈化工作臺SW-CJ-1FD、立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-30SII：上海博訊實業有限公司醫療設備廠;恒溫培養振蕩器ZWYR-4912：上海智城分析儀器制造有限公司;紫外可見分光光度計UV-5800（PC）：上海元析儀器有限公司;顯微鏡BA410E：麥克奧迪實業集團有限公司;3 L 5BG發酵罐：上海保興生物設備工程有限公司。

1.1.3 培養基配方

平板瓊脂培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L，pH值7.0 g/L，121 ℃條件下滅菌20 min。種子培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0，121 ℃條件下滅菌20 min。原始發酵培養基：蔗糖20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，K2HPO4 30 g/L，CaCl2 030 g/L，MgSO4 050 g/L，pH值7.0，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養條件

平板培養條件：從-80 ℃ 冰箱取出保藏菌株，在固體平板上劃線進行菌株活化，37 ℃過夜培養。種子培養條件：挑取平板上的單菌落接種到種子培養基中，裝液量50 mL/250 mL，180 r/min，37 ℃培養16 h。發酵培養條件：按5%（體積分數，下同）接種量將種子液接種到裝液量50 mL/250 mL的發酵培養基中，180 r/min，37 ℃培養至穩定期。

1.2.2 測定指標和方法

取穩定期菌液，原始發酵培養基作為空白對照，使用紫外可見分光光度計測定OD600值。將菌液稀釋到合適倍數后涂布到平板瓊脂培養基上，計算活菌數。

1.2.3 菌株生長曲線的測定

將培養好的種子液，按5%的接種量接種于50 mL/250 mL的錐形瓶中，180 r/min，37 ℃培養。接種后每2 h取樣1次，測定菌液的OD600值，以未接種種子液的發酵培養基作為空白對照。

1.2.4 6因素2水平正交試驗

根據原始發酵培養基選擇6個因素：蔗糖，蛋白胨，酵母浸粉，K2HPO4，MgSO4和CaCl2，進行6因素2水平正交試驗。依據OD600值，做3個平行，通過極差大小進行數據分析，確定最優因素水平組合。

1.2.5 響應面試驗

根據6因素2水平正交試驗結果，選擇極差最大的3種因素，設計3因素3水平的響應面試驗（Box-Behnken），如表1所示。試驗重復3次，以OD600值為響應值，確定最優發酵培養基。

1.2.6 發酵條件的優化

在優化培養基配方的基礎上，分別對枯草芽孢桿菌Asr的培養溫度（28，31，34，37，40 ℃）、初始pH值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）、接種量（1%，3%，5%，10%，15%）、攪拌轉速（100，150，200，250，300 r/min）4個發酵條件進行3 L小型發酵罐單因素優化試驗[28]，發酵時間為14 h，以OD600值和活菌數作為分析參考依據。

2 結果分析

菌株在原始發酵培養基中的生長曲線如圖1所示。由圖1可知，在0～2 h處于生長延滯期，菌體密度小;2～12 h處于生長指數期，菌體密度上升極快，菌體數量急劇增多;在12 h時達到峰值;12～24 h處于生長穩定期，菌群數量維持穩定。因此選取12 h作為正交試驗、響應面試驗的測試時間，此時枯草芽孢桿菌為對數生長末期，既可以保持高的細胞活力，又可以獲得盡可能多的細胞數。

2.2 6因素2水平正交試驗結果分析

6因素2水平正交試驗設計及極差分析如表2所示，正交試驗方差分析如表3所示。根據極差分析結果，各因素對OD600值的影響順序依次是：酵母浸粉>MgSO4>CaCl2>蔗糖>K2HPO4>蛋白胨;根據方差分析，酵母浸粉，MgSO4，CaCl2對OD600值具有顯著影響。可以分別選擇蔗糖、K2HPO4、蛋白胨的最好水平，即蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO4 3 g/L，通過響應面法重點考察酵母浸粉、CaCl2和MgSO4 3個主要因素對菌株的影響。

2.3 響應面試驗設計與結果分析

利用響應面軟件（Design Expert 8.0）中的Box-Behnken設計以酵母浸粉、MgSO4和CaCl2 3個因素為自變量的試驗，將OD600值作為響應值，共有17個試驗點，每個試驗點設3個平行。17個試驗點可分為2類：一類是中心試驗點，中心試驗點重復5次，以估計試驗誤差[29-31];另一類是非中心試驗點，共12個。試驗設計及結果如表4所示。

對回歸模型進行方差分析，結果如表5所示。由表5可知，酵母浸粉和MgSO4對OD600值均具有顯著影響（P<0.05），回歸模型P值<0.01，達到極顯著水平，失擬項的P值>0.05，為不顯著水平。說明所構建的回歸模型顯著，能夠真實反映試驗情況。決定系數R2=0.963 5，修正決定系數R2=0.916 6>0.900 0，說明回歸模擬程度好。

為進一步研究相關變量因素之間的交互作用，確定最優點，利用軟件分析二次回歸模型，繪制了3個影響因素之間的響應面分析立體圖和等高線圖，如圖2所示。圖2中等高線均呈橢圓形，表明各因素的交互作用顯著[32]，同時得到最佳培養基配方為酵母浸粉8.65 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L。經過3次重復試驗，OD600值達到4.18，相比培養基優化前，提高了17%;菌數平均數從1.85×108 cfu/mL提高到3.25×108 cfu/mL，提高到培養基優化前的1.76倍。

2.4 培養條件的優化

2.4.1 不同培養溫度對菌株發酵產量的影響

低溫和高溫對枯草芽孢桿菌Asr的生長均有不同程度的影響，溫度過高或過低都會延遲枯草芽孢桿菌的生長，降低生物合成量。在28～40 ℃溫度范圍內，出現生長拐點，37 ℃時OD600值最大（見圖3 a））。因此枯草芽孢桿菌Asr的最適宜發酵溫度為37 ℃。

2.4.2 不同初始pH值對菌株發酵產量的影響

初始pH值高呈堿性，會破壞枯草芽孢桿菌細胞膜的電荷，從而降低枯草芽孢桿菌對營養物質的吸收及利用率;pH值低呈酸性，會降低菌體細胞內多種酶的活性[31]。初始pH值為7.0時，與其他初始pH值組D600值存在較大差異;當培養液初始pH值為7.5時，發酵液OD600值開始顯著下降（見圖3 b））。因此，枯草芽孢桿菌Asr最適宜初始pH值為7.0。

2.4.3 不同接種量對菌株發酵產量的影響

枯草芽孢桿菌接種量過大，會導致發酵液中初始菌濃度偏高，減小菌體擴增倍數，抑制菌體代謝生長，還會導致菌體溶氧量的競爭性抑制，降低菌體活性和生產效益;接種量過小，則會降低單位時間內的產量[33];當接種量為10%時，OD600值最大（見圖3 c））。因此得出，枯草芽孢桿菌Asr最適宜接種量為10%。

2.4.4 不同攪拌轉速對菌株發酵產量的影響

攪拌轉速的主要作用是調節培養基溶氧量，滿足枯草芽孢桿菌對氧氣的需求。轉速過快會造成培養基分層，對菌體產生機械損傷，造成菌體衰亡，菌體數量減少;轉速過慢，溶氧量不足，培養基易形成沉淀，不利于菌體的生長和繁殖[33]。當攪拌轉速達到250 r/min時，OD600值最大（見圖3 d））。因此，枯草芽孢桿菌Asr的最適宜攪拌轉速為250 r/min。

3 結果與討論

枯草芽孢桿菌Asr的菌體產量與培養基成分和發酵條件有關。本研究顯示，培養基成分中酵母浸粉對菌體產量的影響最大，與已有文獻的研究結果一致。可能是由于酵母浸粉中含有豐富的蛋白質等營養物質，能夠被菌株快速吸收，從而促進菌株的生長繁殖。在發酵工業中，接種量的大小直接影響活菌數量的增長，較大的接種量可以使菌株快速生長繁殖，增大菌株活力，但過大的接種量會使菌株過早老化，影響菌體產量[34-35]。本研究得出枯草芽孢桿菌Asr的最佳接種量為10%。

本研究采用的初始發酵培養基與大多數研究學者采用枯草芽孢桿菌發酵所用培養基成分一致[26-27]，但對枯草芽孢桿菌Asr的發酵能力偏低，因此前期試驗對培養基成分中的無機鹽進行了調整，作為本研究的原始發酵培養基。采用正交試驗、響應面試驗對既定培養基的發酵工藝進行優化，提高了枯草芽孢桿菌Asr的菌體產量;得出最佳培養基配方為蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉8.65 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L;最佳培養條件為溫度37 ℃、初始pH值7.0、接種量10%、攪拌轉速250 r/min。應用優化配方及工藝，枯草芽孢桿菌Asr菌株最高產量可達到7.30×108 cfu/mL，菌體產量較優化前提高了3.95倍。研究結果可為后續發酵罐的擴大培養、提高菌體產量提供技術支撐，也可為其他枯草芽孢桿菌發酵培養基的優化研究提供借鑒。

本研究僅在搖瓶和3 L發酵罐條件下對枯草芽孢桿菌Asr菌株的發酵工藝進行了初步探索，對該菌的產芽孢量及發酵過程中抗菌蛋白的增加量尚有待作進一步的研究。后期還需在工廠10 t發酵罐進行放大試驗，逐步實現產業化生產。

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