黃芩苷對豬鏈球菌體外抗菌活性試驗

王 留 劉秀玲 梁 博

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南商丘 476100）

黃芩是我國傳統(tǒng)中藥，是唇形科多年生草本植物黃芩的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性寒味苦，可除濕、止血安胎、治療肺熱、咳嗽、濕熱、黃痘等，具有抗菌、抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗氧化等作用。黃芩苷是從中藥黃芩的干燥根中提取分離得到的一類黃酮類化合物，屬葡萄糖醛酸苷類，也是黃芩中藥材中含量最多的黃酮類化合物，含量高達12.1%。藥理研究已證明，黃芩苷具有清熱鎮(zhèn)靜、抑菌抗炎、抗氧化等多方面作用[1-2]。本研究通過體外試驗測定黃芩苷對豬溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度、生長曲線和溶血素活性抑制等試驗，探討黃芩苷對豬溶血性鏈球菌的抗菌作用及機制，為開發(fā)用于豬鏈球菌病治療的黃芩新獸藥制劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

黃芩苷，購于四川天然藥物有限公司，含量85%，為淡黃色結(jié)晶粉末。用二甲基亞砜配置成12.8 mg·mL-1的溶液備用。

1.2 試驗菌株及培養(yǎng)基

豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株、Todd-Hewitt肉湯培養(yǎng)基（THB）、無菌脫纖維兔血購于上海索爾生物科技有限公司。THB培養(yǎng)基按說明書配制，121℃高壓滅菌后備用。

1.3 黃芩苷最小抑菌濃度測定

采用微量稀釋法[3]測定黃芩苷對豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株的最小抑菌濃度（MIC），經(jīng)2倍倍比稀釋后，黃芩苷的終濃度分別為1 280、640、320、160、80、40、20、10 μg·mL-1。試驗重復(fù) 3 次，取 3次試驗結(jié)果的平均值作為黃芩苷對豬鏈球菌2型的MIC。

1.4 豬鏈球菌生長曲線測定

參考張偉等[4]文獻報道的方法，豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株接種于100 mL THB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（37℃，200 rpm）至對數(shù)生長前期（OD600nm＝0.3），分裝于5個50 mL錐形瓶中，每瓶15 mL。分別在5個錐形瓶的豬鏈球菌培養(yǎng)物中加入黃芩苷溶液，使培養(yǎng)液中黃芩苷的終濃度分別為0、8、16、32、64 μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)至5 h，期間每隔0.5 h分別測定每瓶豬鏈球菌培養(yǎng)物的OD600nm光密度值，繪制豬鏈球菌的生長曲線。

1.5 豬鏈球菌溶血素活性抑制試驗

豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株接種于100 mL THB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（37℃，200 rpm）至對數(shù)生長前期（OD600nm＝0.3），分裝于5個50 mL錐形瓶中，每瓶15 mL。分別在5個錐形瓶的豬鏈球菌培養(yǎng)物中加入黃芩苷溶液，使培養(yǎng)液中黃芩苷的終濃度分別為0、8、16、32、64 μg·mL-1，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長后期。分別將每瓶豬鏈球菌培養(yǎng)物10 000 rpm高速冷凍離心1 min，分離上清液。分別在1.5 mL離心管加入磷酸鹽緩沖液（PBS）875 μL、豬鏈球菌培養(yǎng)物上清液100 μL、脫纖維兔紅細胞25 μL，混勻，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置0.5 h，然后10 000 rpm高速冷凍離心1 min，分離上清液，測定上清液的OD450nm光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩苷最小抑菌濃度

試驗結(jié)果顯示，黃芩苷對豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株的最小抑菌濃度大于1 280 μg·mL-1，說明黃芩苷對豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株抑菌效果較差。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有廣泛的藥理活性和生物學(xué)功能[1]。陳功義等[5]采用細胞模型試驗研究了黃芩苷對豬細小病毒感染豬腎細胞的體外作用，結(jié)果顯示黃芩苷能夠顯著阻斷豬細小病毒感染豬腎細胞，對豬細小病毒引起的細胞病變有一定的抑制作用，阻斷和抑制效應(yīng)與黃芩苷的濃度梯度呈正相關(guān)。閆靜等[6]體外試驗結(jié)果表明，黃芩苷能夠干擾病毒的復(fù)制和阻滯病毒的侵入，能有效抑制傳染性法氏囊病毒感染雞胚成纖維細胞。楊靜[7]采用微量稀釋法研究了黃芩苷對豬常見致病菌的最小抑菌濃度，結(jié)果表明黃芩苷對豬大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抗菌活性，對鏈球菌抗菌效果較差，對沙門氏菌和巴氏桿菌無明顯的抗菌作用。魏滋鴻等[8]、張偉等[9]、劉通等[10]分別研究了黃芩提取物對單增李斯特菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌的抗菌作用，結(jié)果提示黃芩提取物對單增李斯特菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌無抑菌作用。本試驗結(jié)果顯示黃芩苷對豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株抑菌效果較差。

2.2 黃芩苷對豬鏈球菌生長曲線的影響

豬鏈球菌生長曲線見圖1，試驗顯示黃芩苷在0～64 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)對豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株的生長無抑制作用。魏滋鴻等[8]、張偉等[9]、劉通等[10]分別研究了黃芩提取物對單增李斯特菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌生長曲線的影響，結(jié)果提示黃芩提取物在0～64 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)對單增李斯特菌、豬鏈球菌、金黃色葡萄球菌的生長無抑制作用，本試驗結(jié)果與其相一致。

2.3 黃芩苷抑制豬鏈球菌溶血素活性

黃芩苷抑制豬鏈球菌溶血素活性試驗結(jié)果見表1，結(jié)果表明黃芩苷與豬鏈球菌2型SS2 ATCC 43765參考菌株共培養(yǎng)后，能夠顯著抑制培養(yǎng)物上清液中豬鏈球菌溶血素的溶血活性，黃芩苷添加濃度為32～64 μg·mL-1時，豬鏈球菌溶血素活性與對照組（0 μg·mL-1組）相比差異顯著。溶血素是豬鏈球菌2型細菌產(chǎn)生的一種外毒素，具有溶血和細胞毒性，是豬鏈球菌的主要毒力因子，對豬鏈球菌的感染和免疫都有重要影響，破壞溶血素的溶血活性是降低豬鏈球菌致病力的主要治療措施之一。張偉等[9]、李根等[11]、陳慶忠等[12]分別研究了黃芩提取物、藥桑提取物、銀杏葉提取物對豬鏈球菌溶血素活性的影響，試驗結(jié)果顯示黃芩提取物、藥桑提取物、銀杏葉提取物均可顯著抑制豬鏈球菌溶血素介導(dǎo)的溶血活性，本試驗結(jié)果與其相一致。

表1 黃芩苷對豬鏈球菌溶血素活性的抑制作用