紅心獼猴桃果酒抗氧化及抑制人肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性研究

秦晉穎 ，謝曉林，朱 燕，許譯文，劉志剛，蔡 倪，韓 琳

（1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽 550005；2.貴州省輕工業(yè)科學(xué)研究所，貴州貴陽 550007）

貴州六盤水紅心獼猴桃果肉顏色鮮艷，口感香甜細(xì)膩，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。目前紅心獼猴桃市場(chǎng)主要集中于鮮果生產(chǎn)及銷售，加工產(chǎn)品種類和數(shù)量有限，通過紅心獼猴桃果酒開發(fā)，提升產(chǎn)品附加值是促進(jìn)當(dāng)?shù)胤N植農(nóng)戶增收的有效途徑。獼猴桃果酒是以新鮮獼猴桃果實(shí)或果汁為原料，經(jīng)發(fā)酵而成的一種低度酒，采用原汁發(fā)酵，保留了獼猴桃水果最初的果香，酸甜適中，同時(shí)在釀造過程中，酵母代謝及酶促作用分解了部分大分子物質(zhì)，使果酒中含有豐富的功能成分，入口醇厚、爽口，因風(fēng)味獨(dú)特并富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在眾多果酒產(chǎn)品中獨(dú)樹一幟，市場(chǎng)前景廣闊[1-3]。

盡管類型眾多的果酒打著營(yíng)養(yǎng)保健功能的旗號(hào)大行其道，然而具體營(yíng)養(yǎng)成分、含量及功能性并不明確，果酒賣點(diǎn)宣傳模糊，針對(duì)性不強(qiáng)。與此同時(shí)，食品已經(jīng)日益成為發(fā)現(xiàn)生物功效成分的重要途徑，有學(xué)者對(duì)沙果果酒和葡萄酒等產(chǎn)品中的生物活性進(jìn)行了研究[4-6]，目前有關(guān)獼猴桃果酒的生物功能研究有限，本研究以貴州六盤水紅心獼猴桃果酒為對(duì)象，對(duì)其抗氧化及抗腫瘤活性進(jìn)行初步探究，以期為提升紅心獼猴桃加工產(chǎn)品附加值，為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試樣：紅心獼猴桃果酒樣品由六盤水涼都獼猴桃集團(tuán)公司提供。

試劑及耗材：DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS（2,2-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽）、維生素C、沒食子酸、丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、DMSO 均為分析純，乙醇、鹽酸和甲醇等，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，試驗(yàn)用水為二次重蒸水。The CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent (MTS 試劑) 和luciferase 測(cè)試試劑盒購(gòu)自Promega 公司(Madison,WI,USA)。改良型DMEM 高葡萄糖培養(yǎng)基購(gòu)買于Sigma 公司，胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco 公司，肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

儀器設(shè)備：UV-2550 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Electron 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52A 型，上海亞榮；MA110 型分析天平，上海良平儀器儀表；DL-166RH 型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[5-6]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取酒樣用乙醇稀釋20 倍，取酒樣稀釋液2.0 mL，加入0.2 mM DPPH 乙醇溶液2.0 mL，搖勻，避光靜置45 min，以乙醇為空白，于517 nm 處測(cè)定吸光度，另取2.0 mL 乙醇與2.0 mL DPPH 乙醇溶液混勻，相同波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每份樣品平行操作3 次，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品清除DPPH 自由基的能力。

1.2.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[7-9]，分別取250 μL、200 μL、150 μL、100 μ L、50 μ L酒樣置10 mL容量瓶中，乙醇稀釋定容。將不同濃度的酒樣2.0 mL 與2.0 mL ABTS+反應(yīng)液混合均勻，暗處反應(yīng)5 min，于734 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值為A1，用蒸餾水代替酒樣與ABTS+混合均勻測(cè)定吸光度值為A0，依文獻(xiàn)中公式計(jì)算ABTS自由基清除率，并通過統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算IC50值。

1.2.3 HepG細(xì)胞活力測(cè)試

MTS 測(cè)試[10-12]：將人肝癌HepG2-C8 細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)液中（10 %胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隨行細(xì)胞計(jì)數(shù)，待細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)1×106左右，加入2.0 mL 0.25 %胰蛋白酶-EDTA 溶液于培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞2 min，加入DMEM 培養(yǎng)基適量后轉(zhuǎn)移至離心管中，將所收集細(xì)胞液以3000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min，棄掉上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，吹打均勻，以5000 個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，置于37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

將獼猴桃果酒不同濃度提取物及陽性對(duì)照用DMSO 溶解，用1%FBS 細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成不同濃度梯度。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組和實(shí)驗(yàn)組，空白組為0.1 %DMSO 細(xì)胞培養(yǎng)液100 μ L；實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度（12.5 μM、25.0 μM、50.0 μM、100.0 μM、200.0 μM）果酒提取物100 μ L，每個(gè)濃度梯度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μ L 含適量MTS 測(cè)試液細(xì)胞培養(yǎng)液，鋁箔紙包裹后置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀于檢測(cè)波長(zhǎng)520 nm 處測(cè)定每孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，以上實(shí)驗(yàn)組分別測(cè)試給藥1 d、3 d、5 d。

1.2.4 Luciferase-ARE測(cè)定

HepG2 細(xì)胞來源于肝癌細(xì)胞的粘附性上皮樣細(xì)胞，常用于研究細(xì)胞保護(hù)、抗遺傳毒性和協(xié)同基因毒性的工具。本研究通過測(cè)定Luciferase 活性，研究獼猴桃果酒提取物激活Nrf2信號(hào)通路的能力，從而為闡述其潛在的抗腫瘤活性作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。測(cè)試方法參考文獻(xiàn)[12]，用12 孔板隔夜培養(yǎng)HepG2-c8 細(xì)胞，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞密度種板，萊菔硫烷（SFN）作為陽性對(duì)照，采用0.1 % DMSO 和不同濃度的獼猴桃果酒提取物處理細(xì)胞24 h，移除培養(yǎng)基，用PBS 清洗細(xì)胞，加入100 μ L 裂解緩沖液，經(jīng)-80 ℃凍融循環(huán)后于冰臺(tái)上刮取細(xì)胞，4 ℃冷凍離心機(jī)10000 r/min 離心10 min，取上清液，加入50 μ L Luciferase 測(cè)試試劑，在Luminometer 發(fā)光儀上讀取吸光值，通過所測(cè)得BCA 蛋白濃度進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算。

表1 獼猴桃果酒提取物抗氧化作用

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用Student's t-test 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅心獼猴桃果酒抗氧化能力

從表1 中測(cè)定結(jié)果可看出，獼猴桃果酒提取物對(duì)DPPH 自由基有一定的清除能力，IC50值為58.32 μg/mL，而陽性對(duì)照VC的IC50值為11.27 μg/mL，說明其清除效果大大低于VC。同樣，獼猴桃果酒提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力也低于VC，其IC50值分別為32.56 μ g/mL 和5.76 μ g/mL，綜上，獼猴桃果酒提取物有一定的抗氧化活性，但效果一般。

2.2 人肝癌HepG2細(xì)胞抑制率

分別于給予獼猴桃果酒提取物第1 d、3 d、5 d進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定，從圖1 可看出，獼猴桃果酒提取物給藥組HepG2細(xì)胞活力均有明顯下降，且表現(xiàn)出時(shí)間和劑量依賴性，獼猴桃果酒提取物200 μ M處理5 d 后，HepG2 細(xì)胞活力均在70 %左右，表明獼猴桃果酒提取物對(duì)HepG2 細(xì)胞具有一定的抑制作用，該劑量被選擇用于隨后的實(shí)驗(yàn)。

2.3 Luciferase-ARE測(cè)定

測(cè)定結(jié)果見圖2，可以看出獼猴桃果酒提取物誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)無劑量依賴性，與對(duì)照組相比，分別以62.5 μ M 和125 μ M 獼猴桃果酒提取物處理后，熒光素酶表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.46 倍和3.78倍，SFN (10 μ M)陽性對(duì)照處理后熒光素酶活性大幅增加9.74 倍，與預(yù)期一致，表明獼猴桃果酒提取物可以激活Nrf2信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。基于每組蛋白質(zhì)濃度計(jì)算得到熒光素酶表達(dá)，與對(duì)照組相比各組間均P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

3.1 有文獻(xiàn)報(bào)道獼猴桃具有抗氧化功效[13-16]，目前對(duì)于紅心獼猴桃的研究主要集中在以VC為代表的成分測(cè)定和深加工產(chǎn)品開發(fā)等方面，有關(guān)其他功效成分及生物活性研究鮮見文獻(xiàn)報(bào)道，通過本研究發(fā)現(xiàn)，紅心獼猴桃果酒提取物對(duì)DPPH 自由基和ABTS+自由基具備一定的清除能力，但其清除能力較弱，與VC 相比較，獼猴桃果酒提取物沒有體現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。

3.2 本研究首次對(duì)紅心獼猴桃抑制肝癌HepG2 細(xì)胞體外增殖活性進(jìn)行了研究，獼猴桃果酒提取物200μ M 處理5 d 后，HepG2 細(xì)胞活力降至70 %以下，表明獼猴桃果酒提取物對(duì)HepG2細(xì)胞具有一定的抑制作用，具備潛在抗癌活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，激活Nrf2 信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)節(jié)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄是其抑制肝癌HepG2細(xì)胞可能的作用機(jī)理。