建立及超聲評估血友病性關節(jié)炎動物模型

劉 昊，馬 菲，張亞如，高 揚，易 梅，馮曉勤，孫 競，李穎嘉*

(1.南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院超聲醫(yī)學科，2.兒科，3.血液科，廣東 廣州 510515)

血友病是一種遺傳性凝血因子缺乏性疾病，患者常出現(xiàn)自發(fā)性出血或創(chuàng)傷后出血不止，關節(jié)腔是最常見出血部位，關節(jié)腔長期反復出血會導致以慢性滑膜炎、軟骨及骨質破壞為特征的血友病性關節(jié)炎(hemophilic arthritis, HA)。通過反復向兔膝關節(jié)腔內注射血液建立血液誘導型關節(jié)炎(blood-induced arthritis, BIA)模型可模擬血友病患者關節(jié)頻繁出血，所致病理改變與HA類似，但隨注射血液劑量和頻率不同，成模效果有所差異[1-2]。此外，向兔膝關節(jié)腔內注射右旋糖酐鐵，短期內也可引起含鐵血黃素沉積、滑膜充血、水腫等類似HA病理表現(xiàn)。既往研究[1-2]多通過測定關節(jié)活動度及病理結果判斷造模效果。本研究建立兔HA模型，以超聲進行監(jiān)測，觀察不同方法的造模效果，并評價超聲監(jiān)測模型關節(jié)病變的價值。

1 資料與方法

1.1 實驗動物分組及造模 將25只清潔級雄性健康3～4月齡新西蘭大白兔(南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體質量2 000～2 500 g)分為A、B組(各5只)及C組(15只)，于肌內注射速眠新和阿托品混合液麻醉后造模。自兔耳中動脈抽取1 ml血液注射到兔膝關節(jié)腔內，A組每周3次，持續(xù)12周，共36次，B組每周2次，持續(xù)12周，共24次；C組：向兔膝關節(jié)腔內注射1 ml右旋糖酐鐵注射液(鐵含量50 mg/ml)后，根據(jù)造模時間分為C1組(誘導4周)、C2組(誘導8周)及C3組(誘導12周)，每組各5只。

1.2 行為學觀察 開始造模后，參考Lequesne MG行為學評分量表(LM評分，內容包括疼痛刺激反應、步態(tài)、膝關節(jié)屈伸角度及關節(jié)腫脹程度，總分11分)評估兔膝關節(jié)運動功能，總評分越高代表關節(jié)運動功能越差[3]。

1.3 超聲檢查 將動物麻醉后以平臥位保定于操作臺上，使其膝關節(jié)伸直，備皮后在髕腱前方涂抹耦合劑并放置導聲墊。以Toshiba Aplio500超聲診斷儀、18L7高頻線陣探頭平行于髕腱長軸進行掃查，顯示膝關節(jié)矢狀切面，觀察滑膜并測量其厚度；切換到彩色多普勒模式，按照Newman標準[4]選取血流信號最豐富切面進行半定量評分：0級，滑膜內未見明顯彩色血流信號；1級，滑膜內見點狀彩色血流信號；2級：滑膜內見條狀彩色血流信號，血流充盈面積小于滑膜總面積的50%；3級，滑膜內見豐富條狀彩色血流信號，血流充盈面積≥滑膜總面積的50%。參考Disler標準對軟骨損傷進行超聲評估[5]：0分，軟骨表面光滑完整；1分，軟骨表面不光滑，但無明顯缺損；2分，軟骨表面局部凹陷，無全層缺失；3分，軟骨全層缺失。

1.4 病理檢查 造模結束后處死動物，自髕上囊處切開膝關節(jié)腔，暴露滑膜組織，肉眼觀察滑膜和軟骨大體表現(xiàn)。完整剝除滑膜組織，固定、石蠟包埋后行HE染色，光鏡下觀察滑膜組織。截取股骨遠端，固定、脫鈣、脫水、石蠟包埋后行HE染色，觀察潮線完整程度、軟骨細胞數(shù)量及基質染色深淺。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。計量資料以±s表示，以t檢驗或t'檢驗比較組間關節(jié)運動評分及超聲參數(shù)評分。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

造模過程中A、B組各1只兔死亡，C組全部存活。造模期間各組LM評分均逐漸升高。造模結束時，C3組LM評分最高(8.80±0.75)(表1)。造模結束時，各組左側膝關節(jié)均出現(xiàn)腫脹變形、活動度減退等類似HA關節(jié)功能障礙表現(xiàn)。

表1 各組HA模型兔Lequesne MG評分(±s)

表1 各組HA模型兔Lequesne MG評分(±s)

組別4周8周12周F值P值A組5.00±0.82?6.50±1.29?7.25±1.50?△3.440.07B組1.50±0.584.25±0.96Δ5.00±0.82Δ21.26<0.01C組5.40±1.14?Δ7.60±1.34?Δ8.80±0.75?Δ11.74<0.01F值23.618.4817.40--P值<0.010.01<0.01-- 注:?:與B組比較P<0.05;Δ:與4周時比較P<0.05

2.1 超聲評估滑膜及軟骨 造模結束時各組兔膝關節(jié)腔內均可探及滑膜增生，超聲測得A組[(4.46±0.47)mm]及C組[(4.08±0.44)mm]滑膜厚度均大于B組[(2.43±0.39)mm](P均<0.05)。造模過程中，A組及B組滑膜厚度及血流信號分級逐漸增加(表2)；C組造模初期滑膜厚度及血流信號逐漸增加，4周后(C1組)滑膜最厚、血流信號最豐富(圖1)，隨造模時間延長，誘導8周(C2組)及12周時(C3組)滑膜厚度略微變薄，但差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。造模結束時，超聲顯示A組及C組股骨遠端軟骨均出現(xiàn)損傷，B組造模過程中始終未見軟骨及骨質破壞征象。

圖1 C1組滑膜病理及超聲表現(xiàn) A.滑膜大體表現(xiàn)呈紅褐色絨毛狀；B.光鏡下見滑膜組織內大量炎癥細胞浸潤(黑箭)，含鐵血黃素顆粒散布在滑膜中及巨噬細胞內(白箭)；C.超聲觀察滑膜呈低回聲，其內可見較豐富彩色血流信號(白圈內)

表2 各組HA模型兔滑膜厚度及血流信號分級(±s)

表2 各組HA模型兔滑膜厚度及血流信號分級(±s)

組別滑膜厚度(cm)4周8周12周F值P值滑膜CDFI分級4周8周12周F值P值A組3.01±0.49?3.96±0.68?△4.46±0.47?△5.360.032.00±0.71?2.50±0.502.75±0.431.400.29B組1.67±0.462.28±0.362.43±0.392.280.110.50±0.502.00±0.71△2.25±0.43△8.600.01C組4.42±0.63?4.32±0.70?4.08±0.44?0.340.722.60±0.49?1.00±0.89△0.60±0.49?△10.50<0.01F值22.0910.5019.08--12.033.7821.49--P值<0.01<0.01<0.01--<0.010.06<0.01--

注：*：與B組比較，P<0.05；Δ：與4周時比較，P<0.05

2.2 滑膜及軟骨病理改變 大體觀察各組滑膜均呈紅褐色；B組股骨遠端軟骨表面光滑，色澤蒼白；A組、C1及C2組軟骨色澤欠均勻，局部呈淡紅色；C3組軟骨呈淡紅色，表面毛糙欠光滑，可見凹陷缺損(圖2)。各組滑膜組織光鏡下均表現(xiàn)為襯里層細胞重度增生、炎細胞浸潤及含鐵血黃素沉積；C2、C3組可見滑膜襯里下層膠原纖維增生。各組軟骨組織光鏡下均表現(xiàn)為局部細胞增多及基質染色缺失，以C2組及C3組為著。

圖2 C3組模型軟骨的病理及超聲表現(xiàn) A.軟骨大體觀察呈淡紅色，毛糙欠光滑，可見凹陷缺損(箭)；B.光鏡下軟骨基質著色減少，軟骨內可見裂隙(箭)；C.超聲聲像圖顯示關節(jié)軟骨表面毛糙，局部可見凹陷缺損(箭)

3 討論

本研究嘗試采用3種方式建立兔HA模型，其中A、B組(BIA模型)向關節(jié)腔內反復注射血液，現(xiàn)似HA的臨床表現(xiàn)和病理改變。既往文獻[1-2]針對注射血液建立BIA模型的頻率和劑量的報道不一，單次注射量為0.1～1.5 ml不等。相比微量出血及隱匿性出血，頻繁大量出血更易刺激滑膜增生[6-7]，造模時應盡可能模擬急性大量出血，即注射血液的量應以可充填整個關節(jié)腔為宜，注射頻率從每周3次到每2周1次不等。本研究所用3～4月齡兔膝關節(jié)腔容積約1 ml，故注射血液劑量設定為1 ml。注射過于頻繁會增加關節(jié)腔感染風險，頻繁抽血也可能造成兔貧血，增加造模過程中動物死亡風險；而如果2次注射間隔太長，腔內積血被滑膜完全吸收，難以達到刺激滑膜增生的效果，故本研究采用每周3次(A組)及每周2次(B組)的注射頻率，B組造模時超聲未監(jiān)測到關節(jié)腔內液性暗區(qū)，即前次注射血液已基本吸收，而A組尚能觀測到少許積血存留。造模結束時A組滑膜更厚、血流信號更豐富，且具有軟骨損傷征象，更類似于臨床超聲所見HA表現(xiàn)，且A組模型滑膜增生及軟骨損傷病理改變更顯著[8]。

既往研究[1-2]常根據(jù)關節(jié)活動度及病理檢查評估HA模型關節(jié)病變。關節(jié)活動度只能間接反映關節(jié)病變。病理檢查雖然是評估關節(jié)病變的“金標準”，但需要處死實驗動物，無法動態(tài)監(jiān)測病變進展。超聲可顯示關節(jié)腔積液、滑膜增生、軟骨及骨質破壞等病變，已廣泛用于評估關節(jié)炎及監(jiān)測動物模型[9-10]。本研究中超聲在3組模型中均能觀察到滑膜增生及滑膜內血流信號。A組及B組滑膜厚度及血流信號隨造模時間延長逐漸增加；C組鐵劑誘導4周時(C1組)已出現(xiàn)典型HA病理改變，8周及12周時滑膜襯里下層膠原纖維增生、滑膜纖維化，超聲表現(xiàn)為滑膜厚度減低，彩色血流信號逐漸消退，原因可能是C組僅注射1次右旋糖酐鐵，隨著時間延長，鐵劑被逐漸清除，無法持續(xù)刺激滑膜增生及炎癥反應。

關節(jié)腔出血后，滑膜襯里細胞及巨噬細胞可將積血清除，如果反復或持續(xù)出血，超過滑膜的清除能力，紅細胞內的鐵被巨噬細胞吞噬降解，最終以含鐵血黃素形式沉積在滑膜中[6,11]。鐵不僅能調控原癌基因c-myc及抑癌基因p53表達、促進滑膜細胞增殖，還可參與活性氧的生成過程，加重炎癥反應，并可直接破壞軟骨基質。既往研究[12-13]證實，鐵沉積是血友病關節(jié)損傷的重要因素之一。本研究采用右旋糖酐鐵建立HA動物模型，右旋糖酐鐵可被滑膜內的巨噬細胞吞噬降解為含鐵血黃素，向關節(jié)腔內注射右旋糖酐鐵可模擬長期反復出血后的大量含鐵血黃素沉積，刺激滑膜增生，造成軟骨破壞等類似HA表現(xiàn)。與血液誘導型關節(jié)炎模型相比，鐵劑誘導型關節(jié)炎模型僅需4周即可模擬HA特征性表現(xiàn)，造模周期短，操作簡單，動物死亡風險更低，且誘導的關節(jié)炎病理改變更顯著，便于超聲監(jiān)測及評估。

本實驗通過血液誘導和鐵劑誘導兩種方法建立HA兔模型，其癥狀、影像學表現(xiàn)及病理改變能模擬HA特征性表現(xiàn)，后者造模更為快速、簡便；超聲可作為動態(tài)監(jiān)測模型病變進展的較理想的影像學手段。