HDAC抑制劑調控免疫細胞功能及在自身免疫病中的應用進展

申艷佳，楊 冉，陳 渺，王金華，張 莉，李 莉，杜冠華

(中國醫學科學院&北京協和醫學院藥物研究所，北京市藥物靶點研究與新藥篩選重點實驗室，北京 100050)

染色質組蛋白的乙酰化水平在基因的表觀遺傳學調控和細胞的生理功能調節中具有關鍵作用。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑可抑制HDACs的活性，大量研究報道，HDAC抑制劑可以抑制腫瘤細胞的增殖和誘導細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用，已廣泛用于抗腫瘤治療[1]。近年來，HDAC抑制劑在免疫系統中的作用研究越來越多，本文對近期HDAC抑制劑對免疫細胞的調控作用及在自身免疫病中的應用進行綜述，以期為后續研究提供參考。

1 HDACs家族

迄今為止，已在哺乳動物細胞內鑒定出18種HDACs，根據其結構域和酵母蛋白序列同源性分為4類[2]。

Fig 1 Classes and subcellular localization of histone deacetylase (HDAC) enzymes

Ⅰ類HDACs與酵母轉錄調節因子Rpd3同源，主要定位于細胞核內且具有較高的酶活性，包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8。

Ⅱ類HDACs與酵母Hda1蛋白同源，分為Ⅱa類HDACs和Ⅱb類HDACs。Ⅱa類HDACs包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9，其特點是蛋白氨基末端延伸，含磷酸化位點和蛋白結合域。Ⅱa類HDACs以磷酸化依賴性方式在細胞核與細胞質之間穿梭。Ⅱb類HDACs包括HDAC6和HDAC10，其特點是蛋白缺乏氨基末端延伸，但具有2個催化結構域。

Ⅲ類HDACs(也稱sirtuins)由SIRT1-7組成，與酵母HDAC蛋白SIR2同源，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依賴性酶。Sirtuins調節多種生物功能，例如氧化壓力、DNA修復、新陳代謝和衰老等。

HDAC11為Ⅳ類HDAC，其具有Hda1和 Rpd3的序列保守性，在腦、心臟、睪丸和腎臟中高表達。Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類的HDACs均為鋅離子依賴型酶，也稱為經典型HDACs。

2 HDAC抑制劑

HDAC抑制劑是一類抑制HDACs活性的分子。根據其化學結構，HDAC抑制劑可分為5類[3]:(1)異羥肟酸類，如曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)、伏立諾他(vorinostat，suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)、貝利司他(belinostat)、帕比司他(panobinostat)和Abexinostat；(2)短鏈脂肪酸類，如丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)和丁酸鈉(sodium butyrate)；(3)環狀肽類，如羅米地辛(romidepsin)；(4)苯甲酰胺類，如恩替諾特(entinostat， MS-275)、西達本胺(chidamide)和tubastatin A；(5)sirtuins抑制劑，如Selisistat(EX-527)和煙酰胺(nicotinamide)。

根據對HDACs的特異性，也可以將這些抑制劑分為4類[3]:(1)廣譜HDAC抑制劑，如貝利司他、曲古抑菌素A(TSA)、伏立諾他(SAHA)和帕比司他，可抑制Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類HDACs活性；(2)Ⅰ類和Ⅱ類HDACs抑制劑:如丙戊酸鈉(VPA)和resminostat；(3)Ⅰ類HDACs特異性的抑制劑:如恩替諾特(MS-275)和CXD-101；(4)選擇性HDAC抑制劑:如citarinostat(ACY-241)、Ricolinostat(ACY-1215)、ACY-738、Tubastatin A、選擇性抑制HDAC6活性的CKD-L和CKD-506和靶向HDAC1的pyroxamide等。

目前，美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration, FDA)已批準上市的HDAC抑制劑有伏立諾他、貝利司他、帕比司他、羅米地辛和丙戊酸鈉，分別用于治療皮膚T細胞淋巴瘤、復發性或耐藥性T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、皮膚T細胞淋巴瘤和癲癇。西達本胺是Ⅰ類和IIb類HDAC抑制劑，于2014年被中國食品藥品監督管理局(China Food and Drug Administration, CFDA)批準用于治療復發及難治性外周T細胞淋巴瘤 。此外還有多種HDAC抑制劑目前正處于臨床試驗各個階段，主要用于抗腫瘤治療。

3 HDAC抑制劑對免疫細胞功能的調控

大量研究證明，HDACs參與調控機體的固有免疫和適應性免疫過程。HDACs主要通過調控Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)和干擾素(interferon，IFN)信號通路影響機體固有免疫過程，而在適應性免疫過程中，HDACs可調控抗原提呈過程，淋巴細胞的生長、分化與極化等。本文以免疫應答過程中發揮作用的免疫細胞為切入點，對近年來HDAC抑制劑在免疫應答中的作用進行綜述。

3.1 HDAC抑制劑對自然殺傷(natural killer, NK)細胞功能的調控HDAC抑制劑可調控NK細胞的凋亡、NK細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷等過程。有報道廣譜HDAC抑制劑TSA可促進NK細胞的凋亡，顯著抑制IL-12、IL-15和IL-18共同誘導的NK細胞IFN-γ的分泌。將NK細胞與慢性粒細胞白血病細胞K562以1 ∶3比例混合，1 μmol·L-1TSA作用于混合細胞24 h可顯著抑制K562細胞的凋亡，這說明TSA可抑制NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用[4]。

有研究顯示，Ⅰ類HDAC抑制劑恩替諾特(MS-275)呈時間和劑量依賴性上調NK細胞表面的主要活化性受體NKG2D(natural killer group 2 member D)表達，促進NK細胞對人結直腸癌細胞HCT-15的識別和殺傷作用，且對NK細胞的活性無顯著影響[5]。而另有研究指出Ⅰ類和Ⅱ類HDAC抑制劑VPA可通過抑制STAT3磷酸化和降低HDAC3表達水平進而下調NK細胞的NKG2D表達，抑制NK細胞對神經母細胞瘤細胞COL、結直腸癌細胞HCT-15和成骨肉瘤細胞SaOS2的殺傷作用[6]。

這些研究表明，不同HDAC抑制劑對NK細胞的作用不同，可能是因為HDAC抑制劑作用的HDACs亞型不同，HDAC抑制劑可通過調控NKG2D的表達水平控制NK細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷作用。

3.2 HDAC抑制劑對樹突狀細胞功能的調控樹突狀細胞是專職抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)，機體受到外部刺激或自身發生損傷時，被激活并募集和活化其他免疫細胞，誘導適應性免疫。研究發現，HDAC抑制劑可調控樹突狀細胞的成熟、遷移、共刺激分子的表達，以及炎癥因子分泌等。預孵育TSA可以劑量依賴性地抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活的樹突狀細胞的抗原提呈活性，其原因為TSA抑制了樹突狀細胞的分化成熟[7]。進一步研究發現，TSA還可以通過調控樹突狀細胞成熟過程，抑制趨化因子受體4(chemokine receptor 4，CXCR4)介導的樹突狀細胞遷移[8]。

CD40是免疫反應重要的共刺激分子，可調控T細胞活化、抗原提呈細胞激活等生物學過程。CD80、CD83和CD86是樹突狀細胞發育成熟的重要指標，而CD80和CD86可作為激活T細胞的重要協同刺激分子。MS-275以及VPA可顯著下調CD40、CD80和CD83的表達，但對CD86的表達影響較小。VPA通過調控核轉錄因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)和IFN調節因子(IFN regulatory factor，IRF)信號通路抑制共刺激物和黏附分子的表達，進而調控樹突狀細胞的分化以及炎癥因子的分泌[9]。

細胞因子是固有免疫反應的標志，不僅可以調控免疫效應T細胞的分化，還可以激活或抑制APC。研究表明， HDAC抑制劑可以調控樹突狀細胞炎癥因子的分泌。VPA可顯著抑制LPS刺激的未成熟樹突狀細胞分泌IL-10、IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α，促進IL-8分泌，從而抑制了LPS刺激的未成熟樹突狀細胞誘導Th17細胞極化[10]。

3.3 HDAC抑制劑對B淋巴細胞功能的調控Ⅰ類HDACs HDAC1和HDAC2對于B淋巴細胞的增殖和生長至關重要。B淋巴細胞內HDAC1和HDAC2同時缺失可阻斷早期B淋巴細胞生長，誘導B淋巴細胞凋亡，單獨敲除兩個基因的任何一個對于B淋巴細胞生長無顯著影響。然而，對于成熟未分裂的B淋巴細胞，同時敲除HDAC1和HDAC2對B淋巴細胞生長、凋亡并無顯著影響[11]。Ⅱa類HDACs 如HDAC4、HDAC5和HDAC7也參與調控B淋巴細胞的活化、分化和凋亡等過程[12]。VPA可通過干擾B淋巴細胞增殖，從而抑制初始B淋巴細胞分化成為分泌免疫球蛋白的漿細胞，但是VPA對記憶性B淋巴細胞的分化及活化并無影響[13]。

3.4 HDAC抑制劑對T淋巴細胞功能的調控CD4+T細胞在誘導適應性免疫中至關重要。研究發現HDAC抑制劑對CD4+T細胞的增殖、凋亡、炎癥因子生成等均具有調控作用。據報道TSA作用小鼠源CD4+T細胞可顯著抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。TSA通過抑制NF-κB的核轉位降低CD4+T細胞中IL-2的表達水平，另外它還可以改變細胞表面蛋白，如IL2Rα、IL2Rβ、LFA-1、CD11c、CD28、CD40和CD40L等的表達水平調控CD4+T細胞的功能[14]。

CD8+T細胞也可稱為細胞毒性T細胞，可通過細胞裂解和凋亡等殺傷腫瘤細胞等。研究顯示，Ⅰ類HDAC抑制劑恩替諾特(MS-275)可通過促進CD8+T細胞的增殖、增強其殺傷活性，以及對腫瘤細胞的識別能力來抑制腫瘤細胞增殖[15]。HDAC6特異性抑制劑ACY-1215則可通過調控CD8+T細胞的活化及功能緩解超敏反應和移植物抗宿主病，ACY-1215作用CD8+T細胞48 h可顯著抑制細胞的增殖，同時ACY-1215可抑制介導初始CD8+T細胞分化為效應CD8+T細胞的關鍵因子IL-2和IFN-γ的表達[16]。

調節性T細胞是一類具有免疫抑制活性的CD4+T細胞亞群。研究發現，TSA可促進組蛋白乙酰化，進而誘導初始CD4+T細胞向調節性T細胞分化；另外，TSA還可增強調節性T細胞對羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoroscein succinimidyl ester，CFSE)標記的初始CD4+T細胞增殖的抑制活性[17]。調節性T細胞可預防小鼠結腸炎并減輕已建立的結腸炎癥狀，而Ⅱa類HDACs HDAC9參與調控調節性T細胞的功能。研究發現，在葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導的炎癥性腸病模型中，廣譜HDAC抑制劑TSA和SAHA(伏立諾他)可增加小鼠淋巴樣組織中調節性T細胞數量，并增強調節性T細胞對CFSE標記的T細胞增殖的抑制活性。HDAC9敲除鼠中調節性T細胞對CFSE標記的效應T細胞的免疫抑制活性增強，FoxP3和IL-10的mRNA水平顯著上調，提示減少調節性T細胞中HDAC9的表達或功能的策略可能用于治療結腸炎或其他自身免疫病[18]。上述研究說明，Ⅱ類HDACs參與調控調節性T細胞的增殖和免疫抑制活性，而抑制Ⅱ類HDACs活性可促進調節性T細胞增殖，并增強其對效應T細胞的免疫抑制活性。

4 HDAC抑制劑在自身免疫病中的應用

HDAC抑制劑廣泛用于腫瘤的治療，也有研究報道，HDAC抑制劑可通過神經保護、神經營養、抗炎等作用治療神經退行性疾病。HDAC抑制劑可調控機體的免疫應答，這提示其可能用于治療自身免疫病。

4.1 HDAC抑制劑與類風濕關節炎表觀遺傳學如組蛋白修飾等在類風濕關節炎中發揮著重要作用。研究表明，HDAC抑制劑可通過調控炎癥因子生成、T細胞分化、巨噬細胞和樹突狀細胞的功能、成纖維樣滑膜細胞增殖等治療類風濕關節炎[19]。

HDAC抑制劑可調控巨噬細胞炎癥反應，抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12的生成[19]。廣譜HDAC抑制劑LAQ824(Dacinostat)顯著降低誘導巨噬細胞和樹突狀細胞遷移的趨化因子及其受體(如MCP-1、MCP-2、MCP-3、CCL15、CCL23、CCR1和CCR5等)的mRNA水平。LAQ824選擇性調控樹突狀細胞的功能，抑制樹突狀細胞介導的Th1細胞活化及遷移，但對Th2細胞無顯著影響[20]。廣譜HDAC抑制劑TSA通過抑制PI3K/Akt信號通路活化，降低類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞的侵襲能力，誘導其凋亡[21]。

在類風濕關節炎動物模型上，Ⅰ類HDACs特異性抑制劑MS-275可以發揮抗關節炎作用[22]。Ⅱb類HDACs HDAC6參與調控類風濕關節炎的病理過程，在膠原誘導的關節炎模型中，選擇性HDAC6抑制劑CKD-L顯著上調Foxp3+T細胞中細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA-4)的表達，并抑制效應T細胞的增殖，進而降低關節炎評分[23]。

上述研究結果提示，HDAC抑制劑有望用于類風濕關節炎的治療，但是應注意研究HDAC抑制劑的選擇性，以減少其應用過程中產生的副作用。

4.2 HDAC抑制劑與多發性硬化HDAC抑制劑對多發性硬化的治療作用研究報道較多。在多發性硬化的經典動物模型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型中，腹腔注射TSA可改善模型組小鼠脊髓炎癥反應，抑制神經元及軸索損傷，研究發現其機制可能與TSA通過誘導T淋巴細胞耐受，抑制T細胞向脊髓浸潤有關[24]。伏立諾他(SAHA)則可通過抑制樹突狀細胞的成熟和分化，抑制TNF-α、IFN-γ、Th1細胞極化因子IL-12p35和Th17細胞極化因子IL-6、IL-23p40的生成，進而緩解EAE模型小鼠中樞神經系統炎癥反應和髓鞘脫失[25]。以上研究提示，HDAC抑制劑亦可作為治療多發性硬化的潛在候選藥物。

4.3 HDAC抑制劑與系統性紅斑狼瘡HDAC抑制劑具有免疫抑制作用，可通過增加調節性T細胞的數量、調控巨噬細胞活化及T細胞和B細胞的分化、抑制促炎細胞因子生成等治療系統性紅斑狼瘡。腹腔注射1.0 mg·kg-1TSA可增加CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的數量，降低脾臟中IL-6的mRNA表達水平并增加TGF-β和Foxp3的表達，減少腎臟中自身抗體的生成[26]。VPA則可選擇性激活單核細胞來源的巨噬細胞，上調M2型巨噬細胞的Marker基因CD163和MRC-1的表達，而下調M1型巨噬細胞Marker基因IDO-1的表達，抑制促炎細胞因子TNF-α的生成，并促進抗炎細胞因子IL-10和TGF-β的產生，進而發揮抗炎免疫作用[27]。然而，非特異性HDAC抑制劑在應用過程中由于機制較為復雜，可能產生副作用，因此需要進一步注意研究HDAC抑制劑的選擇性。

在系統性紅斑狼瘡的動物模型中，HDAC6的表達顯著上調，而抑制HDAC6可顯著改善疾病。HDAC6的特異性抑制劑ACY-738可抑制免疫復合物介導的腎小球腎炎、降低血清中抗雙鏈DNA抗體的水平，降低系統性紅斑狼瘡相關炎癥因子IL-10、IL-6和IL-1β的mRNA水平，減少腎小球中免疫復合物的生成，并增加脾臟中調節性T細胞的數量，進而改善疾病嚴重程度，其機制可能與ACY-738調控T細胞和B細胞的分化相關[28]。CKD-506亦是HDAC6的特異性抑制劑，在先天發病的自發性狼瘡模型NZB/W小鼠中，CKD-506顯著提高模型小鼠生存率，降低血液中尿素氮水平和腎小球中IgG和C3水平，抑制腎炎的發生。CKD-506還可以減少腎臟中促炎細胞因子和趨化因子如IFN-γ、IL-1β、 IL-4、IL-6、IP-10、MCP-1和CCL4等的生成，改善狼瘡性腎炎而無副作用[29]。

4.4 HDAC抑制劑與炎癥性腸病炎癥性腸病是一種以腸黏膜反復出現慢性炎癥為特點的疾病，可導致嚴重并發癥甚至致殘。在DSS誘導的炎癥性腸病模型中，廣譜HDAC抑制劑TSA和SAHA(伏立諾他)可緩解小鼠體質量減輕、出血、腹瀉等癥狀，降低促炎細胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的mRNA水平，增加FoxP3和抗炎細胞因子IL-10的mRNA水平，預防小鼠結腸炎。其機制可能與增加小鼠淋巴樣組織中調節性T細胞數量，并增強調節性T細胞對CFSE標記的T細胞增殖的抑制活性相關[18]。丁酸鹽是一種Ⅰ類和Ⅱ類HDAC抑制劑，可為結腸細胞提供能量，同時具有抗炎和抗增殖的作用，從而維持腸道穩態。丁酸鹽目前被廣泛用于治療炎癥性腸病，其主要作用機制包括調控調節性T細胞的活化、促進組蛋白乙酰化、抑制NF-κB活化以及促進腸上皮細胞分泌粘液等[30]。與其他炎癥性疾病相似，在炎癥性腸病中，HDAC抑制劑可能通過多種機制緩解疾病嚴重程度。

5 總結與展望

HDAC抑制劑具有免疫調節作用，其可調控免疫反應中發揮作用的免疫細胞的生成及功能。HDAC抑制劑主要通過調控樹突狀細胞的成熟分化、調節性T細胞的免疫抑制功能、效應T細胞誘導的免疫反應，以及細胞因子生成等方面治療自身免疫病。然而研究發現，一些廣譜HDAC抑制劑對自身免疫病的療效顯著，但因抑制多種HDAC亞型，可影響機體的多種分子進程，對機體產生不良反應。因此，確定參與疾病過程調控的具體HDACs以及研發其特異性的HDAC抑制劑，將有助于避免藥物在治療自身免疫病中發生的不良反應，是目前HDAC抑制劑研究的重要方向。