銀杏酸對腫瘤的作用研究進展

肖 玉，李 芬，陶澤璋

(武漢大學人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北 武漢 430060)

銀杏屬于銀杏植物科。銀杏樹被認為是地球上最古老的生物之一，已經在森林中繁衍了1.5億年，因此被稱為“活化石”[1]。它已被用作傳統藥物，其葉中含有各種糖苷和萜類化合物，它們可以發揮多種藥理活性，例如抗炎、光保護、保肝,以及在心血管疾病預防和治療中的強心作用等[2-4]。現已有成熟的銀杏葉提取物(ginkgo biloba P.E，GBE)制劑應用于臨床，作為認知功能下降和阿爾茲海默癥的治療用藥。大量藥理研究表明，GBE中萜烯三內酯和類黃酮在認知功能減退治療中發揮主要藥理作用[5]。銀杏酸(ginkgolic acid，GA)也存在于銀杏葉提取物制劑中，由于其潛在毒性，將含量控制在5×10-6以下也成為這種提取制劑的質量控制標準。此時銀杏酸的藥用價值還未得到發掘跟重視，是被當成一種有害物質來認識的。自1997年發現銀杏酸以來，它的分離純化也一直在發展進步。2001年，Teris等[6]利用雙柱高效液相色譜法從銀杏葉中分離出5種銀杏酸，分別為C13：0、C15：0、C15：1、C17：1、C17：2。這其中C15：1，C17：1以及C17：2含量相對較高。相對應的，關于銀杏酸的大部分研究也是圍繞C15：1和C17：1這兩種來展開。

自銀杏酸被作為單獨化合物分離以來，關于其生物活性的研究報道不斷涌現。所覆蓋領域也相當廣，早期主要包括抗菌活性、神經保護作用、病毒的抑制活性、抗炎活性等等。近年來，銀杏酸的抗腫瘤作用被認知并逐漸受到越來越多人的關注。到底這種存在于中國傳統草藥銀杏中的酚酸類化合物對腫瘤的抑制作用如何呢？本文將根據文獻研究，從銀杏酸對腫瘤細胞增殖與轉移的抑制作用入手，探討其發揮影響的深層機制，從而進一步提高我們對銀杏酸的認識。

1 銀杏酸的結構與生物學特性

銀杏酸是銀杏葉中結構相關的正烷基酚酸化合物的混合物，是6-烷基或6-烯基水楊酸的衍生物。根據側鏈的不同可分為五種，結構見Fig 1，其中C15:1含量較高，在其中具有代表性。

Fig 1 Molecular structures of ginkgolic acids

銀杏酸具有多種生物學特性。根據文獻，銀杏酸可直接結合E1連接酶，通過阻斷E1-SUMO中間體的形成來廣泛抑制蛋白質SUMOylation(SUMO化)[7]，它的許多功能也與SUMO化密不可分。例如，銀杏酸作為SUMO化抑制劑，有助于抑制α-突觸核蛋白和tau蛋白的聚集，為帕金森病以及阿爾茲海默癥的治療提供新思路[8-9]。銀杏酸在部分腫瘤細胞中發揮作用也與其SUMO化抑制劑的角色有關。銀杏酸具有破壞MDCK細胞中線粒體和溶酶體的潛在能力，可能有潛在腎毒性[10]。銀杏酸還具有肝毒性， Jiang等[11]的研究表明銀杏酸C15：1引起許多代謝紊亂，包括氧化應激和嘌呤代謝，引起肝損傷。另外，藥物動力學分析表明，銀杏酸Ⅰ和Ⅱ相代謝在人和大鼠肝微粒體中具有相似的代謝特征。參與GA(17 ∶1)代謝的藥物代謝酶為人CYP1A2，CYP3A4，UGT1A6，UGT1A9和UGT2B15[12]。總的來說，銀杏酸能抑制SUMO化，還可抑制部分酶的活性，但有肝腎毒性。除此之外，銀杏酸具有較廣泛的生物活性，其中抗腫瘤特性是近年來研究的熱點及重點。實驗表明，其可在結腸癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌以及乳腺癌的治療中發揮積極的作用，通過不同途徑抑制腫瘤的發生發展。

2 銀杏酸對腫瘤的抑制作用

腫瘤的生長增殖及侵襲轉移受眾多因素的調控。隨著腫瘤發病率的日益提高，尋找高效抗腫瘤藥物迫在眉睫。近年的研究發現，銀杏酸作為實驗中的治療用藥在抑制腫瘤方面有重要的作用。

2.1 銀杏酸與細胞增殖腫瘤細胞的增殖能力關乎其生長速度，是評判其良惡程度的指標之一。對細胞增殖的抑制作用也是篩選抗腫瘤藥物的一個重要方向。銀杏酸以濃度和時間依賴的方式抑制結腸癌細胞系SW480細胞的增殖，當加入50 μmol·L-1銀杏酸時，細胞增殖幾乎被完全抑制[13]。它還顯著降低肺癌細胞系A549和HI299細胞的細胞增殖[14]。在與銀杏酸(10 μmol·L-1)共孵育24 h后，口腔鱗狀細胞癌細胞系Tca8113和Cal-27的細胞活力分別降低了約41.79%和53.53%[15]。人胃癌細胞系，包括BGC-823、SGC-7901、MGC-803和AGS對銀杏酸治療敏感,其中BGC-823和SGC-7901比其他兩個更敏感[16]。在乳腺癌中，Licciardello等[17]發現對于NOTCH1激活的乳腺癌細胞系HCC-38， HCC-1187， HCC-2218和BT-20，銀杏酸可顯著抑制其增殖； Lorente等[18]通過Ki67的表達評估乳腺癌細胞的增殖時，證實暴露于銀杏酸(10 μmol·L-1)會導致增殖降低，并降低與乳腺癌細胞增殖有關的轉錄因子JUN的水平。這種現象不僅出現在體外作用中，實驗表明銀杏酸同樣抑制乳腺癌異種移植物的生長，在體內發揮作用[18]。這種抑制作用對于正常細胞與癌細胞來說具有差異性。Yao等[12]通過實驗證實了銀杏酸在原代大鼠肝細胞中的細胞毒性低于HepG2細胞。銀杏酸在培養4 d的原代大鼠肝細胞中無明顯細胞毒性，而濃度為60 μmol·L-1的銀杏酸降低了HepG2細胞90%的細胞活力。Ma等[19]發現當濃度低于100 μmol·L-1時，銀杏酸可以抑制癌細胞的生長，而對正常細胞的影響很小。這表明銀杏酸對癌細胞有選擇性抑制作用。

2.2 銀杏酸與腫瘤侵襲及轉移腫瘤的細胞轉移涉及多個過程，上皮-間質轉化增強了腫瘤細胞的運動性和侵襲能力，是腫瘤浸潤和轉移的先決條件。腫瘤轉移是復發的最主要因素，也是患者死亡的主要原因之一。同時抑制腫瘤侵襲及轉移也是當前藥物開發的重要方向。

近年來，關于銀杏酸可抑制腫瘤細胞侵襲及轉移能力的研究不斷增加。Baek等[14]發現銀杏酸可降低肺癌細胞的浸潤性，抑制轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導的A549和HI299細胞的侵襲和遷移。在銀杏酸的干預下，HepG2細胞中上皮標志物(E-cadherin和ZO-1)的表達水平升高，間質標志物(波形蛋白和N-cadherin)表達水平降低[20]。相似的，在人胃癌細胞系，銀杏酸降低了ROCK1，基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)，MMP-9和α-SMA蛋白的表達水平；顯著下調了N-cadherin，Vimentin和Snail蛋白的表達水平；而E-cadherin和ZO-1蛋白表達水平呈劑量依賴性增加[16]。Qiao等[13]的研究表明，銀杏酸在轉錄和轉錄后水平下調了SW480細胞中侵襲相關分子的表達，包括MMP-2，MMP-9，尿激酶型纖溶酶激活物和CXC趨化因子受體4型。RAC1可驅動細胞遷移和侵襲程序。研究表明，銀杏酸抑制小GTPase RAC1的激活，損害乳腺癌細胞的侵襲性[18]。此外， Liu等[15]首次評判了銀杏酸對口腔鱗癌細胞的遷移抑制能力，實驗表明濃度為5 μmol·L-1和10 μmol·L-1的銀杏酸對TGF誘導的Tca8113細胞遷移的抑制作用分別為66.3%和96.1%。目前多項研究已將銀杏酸侵襲及遷移抑制潛力作為抗癌新藥可開發的方向。

2.3 銀杏酸與細胞周期阻滯及細胞凋亡細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束的一個完整過程。細胞凋亡是受多種基因精確調控的主動的、程序化的死亡過程[21]。通常，當出現DNA突變后，細胞檢查點將發揮作用阻滯細胞周期，修復損傷或啟動凋亡。誘導細胞凋亡也是腫瘤藥物研究的一個重要方面。

Liu等[22]研究發現，銀杏酸可誘導癌細胞G0/G1期阻滯及細胞凋亡從而導致細胞死亡，發揮抗癌作用。另有研究發現銀杏酸誘導了MDCK細胞G0/G1和G2/M期的細胞周期停滯，還加速了Tca8113和Cal-27細胞的凋亡[10,15]。同樣的，Zhou等[23]的研究表明銀杏酸可劑量依賴性將細胞阻滯在G0/G1期，通過降低Bcl-2/Bax比值來誘導細胞凋亡。可見銀杏酸對G0/G1期的阻滯作用在多種細胞中得到驗證。另外，周大宇[24]的研究表明銀杏酸C13：0可通過誘導線粒體凋亡途徑，即下調Bcl-2、上調Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達，來抑制三陰性乳腺癌的生長。同樣，在對胃癌的研究中，銀杏酸顯著降低了抗凋亡信號Bcl-2和Bcl-xl,而促凋亡分子Bax和Bad在mRNA和蛋白表達水平顯著增加，顯示其發揮了誘導細胞凋亡的作用[16]，再一次證實了其潛在的抗癌活性。劉俊等[25]通過實驗證實，銀杏酸C17：1能調控化療細胞的自噬與凋亡，從而增強順鉑的抗腫瘤活性，產生協同作用，這為化療輔助藥物的機制研究提供了一定理論依據。

3 銀杏酸抑制腫瘤發生發展的相關機制

3.1 作為SUMO化抑制劑發揮抗癌作用SUMO化是蛋白質的翻譯后修飾之一，負責許多細胞過程的調節，例如DNA復制和修復、轉錄、信號轉導和核轉運[26-27]。在SUMO化期間，SUMO蛋白通過酶促級聯共價反應連接到靶蛋白中賴氨酸的ε-氨基，該級聯需要E1、E2和E3酶的連續作用。研究表明，不僅細胞周期和DNA修復途徑相關的許多蛋白質是已知的SUMO化靶標，而且許多人類腫瘤細胞表現出SUMO途徑中相關組分的顯著上調。因此，SUMOylation可能將在潛在的微環境中顯著促進癌細胞的存活和增殖[28]。

銀杏酸可以直接與SUMO化過程中的E1酶結合并減少E1-SUMO中間體的形成，并最終抑制蛋白質SUMOylation[29]。利用這一活性，銀杏酸在多種癌細胞中發揮抑制作用。在銀杏酸抑制SUMO化后，NOTCH1激活的乳腺癌細胞在細胞周期中進行得更慢并最終進入細胞凋亡[17]。Lorente等[18]發現銀杏酸降低了RAC1的SUMO化，從而抑制腫瘤細胞的侵襲。在口腔鱗狀細胞癌中，銀杏酸通過抑制TGF-β1觸發的SMAD4的SUMO化，在體內和體外有效抑制了腫瘤的生長和遷移[15]。在血液系統腫瘤方面，Iba等[30]的研究表明，銀杏酸通過發揮其SUMOylation抑制劑的作用，降低致白血病融合激酶FIP1L1-PDGFRA的穩定性。它與伊馬替尼同用可起到協同作用，是治療FIP1L1-PDGFRA陽性的慢性嗜酸性粒細胞白血病的潛在靶標[30]。綜上，銀杏酸可作為SUMO化抑制劑發揮抗癌作用，目前這是它在腫瘤研究中的主要機制。

3.2 其他腫瘤相關信號通路研究銀杏酸不僅作為SUMOylation抑制劑發揮作用，也可以影響其他腫瘤相關信號通路。首先，信號轉導和轉錄激活因子3是一種致癌轉錄因子。銀杏酸可抑制信號轉導和轉錄激活因子3/Janus激酶2信號通路的激活，這是通過誘導活性氧的產生來實現的[16]。其次，銀杏酸消除了基礎PI3K/Akt/mTOR信號傳導級聯反應，減少了TGF-β誘導的肺癌細胞中PI3K/Akt/mTOR途徑的磷酸化[14]。除此之外，銀杏酸還可通過下調HGF/c-Met信號、激活腺苷5′-單磷酸激活蛋白激酶、減少與脂肪形成有關的關鍵酶的表達而達到抗腫瘤的效果[13,19-20]。但是這里面單個研究較多，機制尚未成熟，可參考價值略小。

4 總結與展望

自1997 年銀杏酸被單獨分析以來，科學家們對它的多種活性進行了研究，可以說是一種生物活性非常廣泛的酚酸類小分子化合物。近五年來，銀杏酸的抗腫瘤活性是其中的研究熱點，在胃癌、胰腺癌、肺癌、結腸癌、口腔鱗狀細胞癌以及乳腺癌等領域均有所報道。

從功能上來看，銀杏酸主要通過抑制腫瘤生長增殖，抑制腫瘤侵襲及轉移，阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡等實現抗腫瘤的效果，并在大部分的文章中得到了驗證。在機制方面，銀杏酸作為SUMO化抑制劑在部分研究中起到關鍵作用。但是其他的腫瘤相關機制研究就比較分散，多為單篇報道，因此說服力較小。銀杏酸本身具有致敏性，這一點在多篇文章中均有闡述，實際上對銀杏酸的藥用價值研究來說這是一個需要解決的問題。另外，銀杏酸具有潛在肝腎毒性，這可能成為阻礙其藥物開發利用的關鍵問題。然而目前關于其代謝及毒理學方面資料不多，還需更加全面深入的研究探討。雖然有關銀杏酸抗腫瘤活性的相關研究近幾年才慢慢開始，研究數據還較少。但是，從目前來看，這些研究基本上都有比較深入的探索，比較完整的實驗，內容較為豐富，從中我們可以看到銀杏酸的抗癌能力，這讓它作為一種潛在抗癌藥物具有很好的研究價值和研發前景。另外，現如今表觀遺傳機制在腫瘤生長發展中的研究已經吸引了越來越多的目光，銀杏酸作為SUMOylation抑制劑，相信在此領域有價值的科研成果會不斷被發現，從而使其作為抗癌新藥研發的潛在候選藥物受到關注。