SAHA靶定組織蛋白酶V誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞自噬

周 慧，韓 翰, 周偉強

(沈陽醫學院 1. 組織學與胚胎學教研室、2. 生物化學與分子生物學教研室、3. 病原生物學教研室，遼寧 沈陽 110034)

癌癥已經嚴重威脅全世界人類生存和社會發展，據世界衛生組織國際癌癥研究所發布的最新報告顯示，乳腺癌是全球女性最常見的癌癥，其發病率在女性癌癥中位居首位。2018年，全球約有209萬乳腺癌病例和62.7萬因乳腺癌而死亡病例[1]。三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌中一類高度異質性的疾病，因無特異性治療靶點，故其主要治療手段仍是化療[2]，但是，化療藥物在臨床上存在藥物種類少、副作用大、耐藥性強等缺點[3-4]，因此亟待進一步探索更有效的治療藥物。

辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)作為第二代組蛋白去乙酰化酶抑制劑，通過抑制組蛋白去乙酰化酶活性，誘導組蛋白過乙酰化，從而改變染色質的結構和基因轉錄，參與細胞分化、調亡、自噬和壞死等一系列生物學效應[5]。

組織蛋白酶V (cathepsin V，CTSV )是一種溶酶體蛋白水解酶，屬于半胱胺酸蛋白酶體系，是11種人半胱氨酸組織蛋白酶(B、C、F、H、L、K、O、S、V、W、X/Z)中的一員[6]。有研究證明[7-8]，組織蛋白酶家族蛋白在SAHA誘導的自噬中起到重要作用，而作為組織蛋白酶家族主要成員的CTSV在自噬過程中是否也起到相關作用還未有報導。本文將SAHA作用于MDA-MB-231細胞，探討CTSV在SAHA誘導乳腺癌細胞自噬中的作用機制，有著重要的理論和實驗意義。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231(EGC076)由本實驗室凍存；Leibovitz’s L-15培養基(KGM41300)和青鏈霉素(KGY0023)購自凱基生物公司，胎牛血清(A3160902)購自美國Thermo公司；SAHA(1604-1)購自美國Biovision公司；High Pure RNA Isolation kit試劑盒(1182866500)購自德國Roche Diagnostics公司；Power SYBR Green PCR Master mix(4367659)，ECL化學發光試劑盒(B2162617)購自美國Life Technologies公司；抗體購自英國Abcam公司；CTSV小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)(SC-44526-SH)購自美國Santa Cruz公司；其他的化學試劑購自美國Sigma-Aldrich公司和上海生工生物有限公司。

1.2 儀器多功能酶標儀(美國Thermo Scientific)；濕式轉膜儀、垂直電泳槽(美國 Bio-Rad)；凝膠成像系統(上海Tanon)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Scientific)；微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo Scientific)；熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific)；低溫離心機(美國Thermo Scientific)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養 人乳腺癌MDA-MB-231細胞培養于含10 %胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的Leibovitz′s L-15培養基中，置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養。將MDA-MB-231細胞接種于96孔板(1×107·L-1)和6孔板(5×108·L-1)各孔中，經過無血清培養基同步化處理后，用于下列實驗。

1.3.2細胞活力檢測 將不同濃度的SAHA(0、0.5、1、2、5、10、20、50 μmol·L-1)與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，經胰酶消化，收集2×105個細胞加入450 μL Count&Viability reagent，室溫避光靜置后應用Muse細胞分析儀檢測細胞活力。

1.3.3CTSV-siRNA轉染 取6.6 μL CTSV-siRNA與125 μL無血清培養基混合，室溫放置5 min。取3.75 μL Lipofectamine 3000與125 μL無血清培養基混合，室溫放置5 min。將上述兩者混勻，室溫放置5 min。將轉染復合物與6孔板中的MDA-MB-231細胞混合，培養24 h后進行后續實驗。

1.3.4RNA提取和Real-time PCR 將SAHA與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，按照RNA提取試劑盒說明進行，合成第一鏈cDNA后應用SYBR Green方法進行Real-time PCR，以GAPDH為內參進行反應，檢測mRNA水平。每個樣品設3個復孔，數據分析采用2-ΔΔCT方法。ULK1引物序列：Forward為5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3′，Reverse為5′-TGGATCCAAGGCTCTAGGTG-3′；ATG3引物序列：Forward為5′-TTTGGCTATGATGAGCAACG-3′，Reverse為5′-GTGGCAGATGAGGGTGATTT-3′； ATG4B引物序列：Forward為5′-GAGCTGCCAAGTCCAGAT TC-3′，Reverse為5′-CCAGGATTTTCAAAGGGACA-3′； ATG4C引物序列：Forward為5′-CCTTGGCTCTTTTT GGCTTA-3′，Reverse為5′-AGGATGCCTTGCTTCTTC AA-3′； ATG5引物序列：Forward為5′-GCAAGCC AGACAGGAAAAAG-3′，Reverse為5′-GACCTTCAG TGGTCCGGTAA-3′； ATG7引物序列：Forward為5′-GAACATGGTGCTGGTTTCCT-3′，Reverse為5′-CAT CCAGGGTACTGGGCTAA-3′；ATG9A引物序列：Forward為5′-GTCAGCTGCGTGGACTATGA-3′，Reverse為5′-GACTTGAGCAGGCAAAAAGG-3′；ATG10引物序列：Forward為5′-GCATTGTAGGGCCAGTTGTT-3′，Reverse為5′-GCTGGCCAGGTAAACTCTTG-3′；ATG12引物序列：Forward為5′-AGGTCTGTAGTC GCGGAGAA-3′，Reverse為5′-GTTCCCGGCTAGT CATTCAA-3′；Beclin 1引物序列：Forward為5′- AGG TTGAGAAAGGCGAGACA-3′，Reverse為5′-GCTTT TGTCCACTGCTCCTC-3′；GAPDH引物序列：Forward為5′- ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，Reverse為5′- ACGACCAAATCCGTTGACTC-3′。

1.3.5Western blot檢測 將SAHA與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白含量。取等量蛋白樣品煮沸10 min，經SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉過夜，洗膜，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，ECL化學發光法顯影。Tanon化學發光成像分析系統檢測結果。

1.3.6細胞免疫熒光法 將SAHA與MDA-MB-231細胞共同孵育24 h，用PBS清洗細胞，4 %甲醛室溫固定10 min，緩沖液室溫封閉2 h。將含有LC3抗體的自噬體檢測試劑在4 ℃下與細胞孵育過夜，用熒光共聚焦顯微鏡對細胞成像并觀察自噬信號。

1.3.7自噬通量阻滯試驗 將SAHA和不同劑量的Bafilomycin A1(0～40 nmol·L-1)孵育MDA-MB-231細胞24 h。Western blot檢測自噬抑制的最佳劑量。然后用CTSV-siRNA轉染細胞，在Bafilomycin A1存在下培養。用Western blot法測定自噬通量，檢測p62蛋白水平，用Muse細胞分析儀檢測細胞活力測定SAHA藥理作用。

2 結果

2.1 SAHA抑制乳腺癌細胞增殖將不同濃度的SAHA與MDA-MB-231細胞孵育24 h后測定細胞活力。結果顯示：不同劑量的SAHA處理后，細胞活力明顯下降。尤其是在2 μmol·L-1SAHA處理的MDA-MB-231細胞中，與對照組相比，活細胞比率從96.1 %下降到59.2 %(Fig 1)。結果表明，SAHA能明顯抑制MDA-MB-231細胞的增殖。

2.2 SAHA增加乳腺癌細胞CTSV的表達SAHA處理后CTSV的mRNA和蛋白水平明顯升高。隨著SAHA劑量的增高，CTSV的最高mRNA水平可達到對照組的214.04倍，CTSV的蛋白水平也明顯升高。該結果證明，SAHA可以促進乳腺癌細胞中CTSV的基因和蛋白水平高表達(Fig 2)。此外，結合SAHA的毒副作用，我們最終確定了SAHA對MDA-MB-231細胞作用的最佳劑量為2 μmol·L-1。

Fig 1 Muse cell analysis for 24 hours SAHA dose-response effects on breast cancer cells (n=3)

2.3 CTSV-siRNA轉染降低乳腺癌細胞中CTSV的基因和蛋白水平用Real-time PCR和Western blot檢測CTSV-siRNA轉染MDA-MB-231細胞后CTSV的mRNA水平和蛋白表達水平。結果顯示：CTSV-siRNA轉染乳腺癌細胞后，與對照組相比，CTSV-siRNA組CTSV的基因和蛋白水平均明顯降低。另外，SAHA可以明顯升高乳腺癌細胞中CTSV的基因和蛋白水平，當SAHA和CTSV-siRNA聯合作用后能夠恢復由CTSV-siRNA干擾引起的CTSV基因和蛋白水平的降低(Fig 3)。該結果證明，CTSV-siRNA轉染可有效降低乳腺癌細胞中CTSV的水平。

2.4 SAHA-CTSV激活乳腺癌細胞自噬標志物LC3的表達用熒光共聚焦顯微鏡觀察了SAHA-CTSV對LC3表達的誘導作用。結果表明，SAHA強烈觸發細胞自噬，隨著SAHA的誘導，標記LC3分子的熒光塊分布在細胞質的大部分區域；而CTSV-siRNA轉染后，細胞熒光亮度降低，呈散簇狀，僅位于細胞膜周圍。最后，當SAHA作用于CTSV敲除細胞時，熒光的分布比未經SAHA處理的細胞更為有限，僅在細胞膜周圍擴散，但熒光的分布和亮度仍強于未經SAHA處理的細胞(Fig 4)。該結果表明，SAHA-CTSV促使MDA-MB-231細胞發生自噬。

Fig 2 Assays for CTSV expressions induced by different doses of SAHA for 24 hours treatment n=3)A： Western blot assay for MDA-MB-231 cells; B： Real-time PCR assay for MDA-MB-231 cells. *P<0.05 vs Basal.

Fig 3 Effect of SAHA on breast cancer cells accompanied by increase of CTSV function n=3)A： Western blot assay for MDA-MB-231 cells; B： Real-time PCR assay for MDA-MB-231 cells. (CVi: CTSV siRNA). *P<0.05 vs Basal, #P<0.05 vs SAHA.

2.5 SAHA-CTSV誘導自噬相關ATGs分子和LC3的變化為了進一步探討SAHA-CTSV誘導乳腺癌發生自噬的機制，我們采用Real-time PCR和Western blot檢測SAHA-CTSV介導的自噬過程中相關ATG和LC3的改變。結果顯示，在MDA-MB-231細胞中，SAHA單獨處理可促進ULK1(ATG1)、ATG4B、ATG4C、ATG5、ATG7、ATG9A、ATG10和Beclin1的mRNA表達。然而，當SAHA被特異性siRNA敲除CTSV功能的細胞處理時，ULK1、ATG4B、ATG10和Beclin1的活性被強烈抑制(Fig 5)。對于蛋白的分析，SAHA增多了MDA-MB-231細胞Beclin1的表達量，并伴有LC3B升高和mTOR降低。CTSV-siRNA的加入逆轉了SAHA效應(Fig 6)。該結果表明，CTSV在SAHA誘導的MDA-MB-231細胞自噬過程中起到重要作用。

Fig 4 Fluorescence microscopy for SAHA-CTSV induced autophagy (n=3) (CVi: CTSV siRNA).

Fig 5 The mRNA expressions of autophagy-related ATGs induced by SAHA-CTSV in breast cancer cells n=3)*P<0.05 vs Basal, #P<0.05 vs SAHA (CVi: CTSV siRNA).

Fig 6 Effect of SAHA-CTSV on protein expressions of ATGs and LC3, Western blot assay for MDA-MB-231 cells (n=3)(CVi: CTSV siRNA).

2.6 Bafilomycin A1阻斷SAHA-CTSV自噬通量時不能發揮抗腫瘤作用為驗證SAHA-CTSV對乳腺癌細胞自噬的誘導作用，通過Bafilomycin A1阻斷自噬的傳遞。首先，篩選了不同劑量的Bafilomycin A1對SAHA誘導的MDA-MB-231細胞自噬的抑制作用。使用不同劑量的Bafilomycin A1(0、5、10、20、40 nmol·L-1)與SAHA處理的MDA-MB-231細胞孵育24 h。通過Western blot分析，可以看到，在5 nmol·L-1Bafilomycin A1或高于該劑量的情況下，p62蛋白的表達與單用SAHA相比明顯增加。接下來，將5 nmol·L-1Bafilomycin A1和SAHA與經CTSV-siRNA轉染的MDA-MB-231細胞共培養24 h。發現如果自噬被阻斷，SAHA不能通過CTSV發揮抗腫瘤的藥理作用。Muse細胞分析儀測定細胞活力結果也證實，在Bafilomycin A1的作用下，乳腺癌細胞雖然與SAHA共培養，但與SAHA單獨培養相比，活細胞數量增加。此外，CTSV基因敲除進一步削弱了SAHA對細胞的影響(Fig 7)。該結果表明，SAHA誘導的MDA-MB-231細胞自噬過程中，CTSV起到重要作用。

Fig 7 The anti-tumor effect of SAHA-CTSV in environment that autophagic flux was blocked by Bafilomycin A1 n=3)*P<0.05 vs Basal, #P<0.05 vs SAHA (CVi: CTSV siRNA, BA1: Bafilomycin A1).

3 討論

自噬是一種保護細胞存活的機制，細胞需要適當的自噬調節[9]。研究表明，自噬在癌癥的發展和治療中也起著“雙刃劍”的作用[10]。一方面，自噬可以為癌細胞提供足夠的營養，另一方面，當長期和過量的藥物作用于細胞時，自噬可以導致不可逆轉的死亡過程[11]。

研究證實，SAHA對乳腺癌細胞的增殖、細胞活力、凋亡和細胞周期進程有明顯影響[12]。進一步的研究發現，SAHA也可能與其他形式的細胞死亡有關，包括自噬性細胞死亡[13]。Fig 6表明，SAHA能明顯促進MDA-MB-231細胞LC3的表達，說明自噬與 SAHA誘導的細胞死亡有關。同時，我們還發現SAHA處理乳腺癌細胞時，CTSV基因和蛋白的表達增加過多。當我們使用CTSV特異性siRNA敲除CTSV mRNA功能時，SAHA誘導的LC3表達明顯受到抑制，細胞死亡過程也受到抑制。該結果提示CTSV在SAHA誘導的乳腺癌細胞自噬中起關鍵作用。由于CTSV是組織蛋白酶家族成員，是溶酶體酶復合物的重要組成部分，而溶酶體是自噬溶酶體的重要組成部分，推測SAHA通過CTSV調節細胞死亡過程。

為進一步揭示SAHA誘導自噬發生發展的潛在機制，我們檢測自噬相關基因和蛋白的表達。我們發現，在SAHA的作用下，ATG4和Beclin1在乳腺癌細胞中的表達明顯改變，LC3B蛋白含量的增加伴隨著mTOR表達的降低。最后，我們用Bafilomycin A1阻斷自噬通量，并測定p62表達的變化，以闡明SAHA-CTSV軸在乳腺癌細胞中的作用。隨著Bafilomycin A1的加入，SAHA和CTSV-siRNA聯合轉染的細胞活力均明顯增加。提示SAHA-CTSV軸通過對乳腺癌細胞的自噬作用發揮抗腫瘤作用。

綜上闡明了SAHA誘導的乳腺癌細胞自噬是由CTSV介導的。SAHA通過CTSV激活自噬標記分子ATG和Beclin1，誘導LC3表達異常增加。通過mTOR轉導，SAHA最終促進自噬溶酶體的合成并引發細胞死亡。我們的研究結果為進一步探索自噬的分子機制，特別是細胞死亡如何應對抗乳腺癌藥物過度自噬，以及其他代謝和信號過程如何協調這一過程奠定了實驗基礎。