天麻素治療缺血性腦卒中導致神經元死亡的作用機制研究

許 鑫，周 欣，楚世峰，李芳芳，鄭清煉，何宏媛，陳乃宏,

(1. 華南師范大學腦科學與康復醫學研究院，廣東 廣州 510631；2. 中國醫學科學院藥物研究所神經科學中心, 天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室, 北京 100050;3. 天津中醫藥大學，天津 301617)

腦卒中是導致我國居民死亡的首位病因[1]，它具有高發病率、高致殘率、高死亡率、高復發率、高經濟負擔的特點[2]，溶栓藥組織型纖溶酶原激活劑(tPA)是唯一被FDA批準的用于抗急性缺血性腦卒中的藥物[3]，但由于存在治療時間窗短，療效有限，易引發出血轉化等風險[4]，難以滿足需求。

神經元死亡是腦卒中的核心病理環節，包括急性和遲發性神經元死亡，遲發性神經元死亡通常表現為細胞凋亡。有研究發現，相關因子生存素(Survivin)能夠抑制線粒體介導的caspase系列引起的細胞凋亡作用，而且Survivin的抗凋亡作用需要乙肝病毒X蛋白結合蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)的協助，HBXIP/Survivin形成的復合物可以拮抗缺血性腦卒中導致的神經元凋亡，改善缺血性腦卒中病變損傷。

天麻素(gastrodin，Gas)作為天麻的主要活性成分之一，對神經衰弱、失眠、頭痛癥狀都有著緩解的作用，其結構式如Fig 1。現代藥理學研究發現，Gas具有多種生物學活性，如楊根夢等[5]研究發現，Gas可減弱神經母細胞瘤細胞(SHSY5Y)自噬，保護神經細胞，SHSY5Y細胞系被廣泛運用于帕金森病發病機制的研究，表明Gas對帕金森病具有一定的影響。趙朝華等[6]研究發現，Gas能夠明顯抑制缺血/再灌注早期S100β的過表達，保護神經膠質細胞正常生長、繁殖和分化；杜亮等[7]研究發現Gas可明顯提高鈉離子、鉀離子和三磷酸腺苷酶的活性，促進大腦細胞能量的代謝，有效清除自由基，減少腦缺血/再灌注造成的損傷；Zhang等[8-9]的研究發現Gas可抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的釋放，改善血腦屏障，減輕腦缺血后的炎癥反應和缺血性腦損傷，這些可看出Gas對缺血性腦卒中的相關治療具有一定的基礎,Gas具有多種藥理活性。

Fig 1 Chemical structure of gastrodin

然而上述研究均聚焦于卒中后24 h內的研究，對于遲發性神經元死亡的影響未見報道。Survivin和HBXIP在Gas的保護作用中的變化尚不清楚。本研究發現，Gas可改善短暫性大腦中動脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)再灌注引發的大鼠遲發性神經元死亡，其機制與凋亡蛋白caspase-3、caspase-8和抗凋亡蛋白Survivin、HBXIP的表達有關。

1 材料

1.1 實驗動物♂SD大鼠，體質量(260～280) g，購自斯貝福(北京)生物科技有限公司(清潔級，合格證編號：SCXK(京)2016-0002)，購入后飼養于中國醫學科學院藥物研究所動物房，室溫維持在(26±2) ℃，相對濕度(55±5)%，12 h/12 h光照/避光循環，自由攝食與飲水。

1.2 實驗藥品與試劑Gas注射液(昆藥集團股份有限公司，批號：110807-201809)；依達拉奉(Edaravone，Eda)注射液(南京先聲東元制藥有限公司，批號：80-190103)；Anti-β-actin抗體、羊抗鼠二抗(sigma公司)；Anti-caspase-3抗體(批號：J2815)、Anti-caspase-8抗體(批號：H0911)、Anti-HBXIP抗體(批號：A2715)(圣克魯斯生物技術公司)；Anti-Survivin抗體(abcam公司，批號：GR3211325-1)；Alexa FlureTM488 donkey anti-mouse二抗(批號：A5441)、Alexa FlureTM546 donkey anti-rabbit二抗(批號：AC026)(賽默飛世爾科技公司)；PVDF膜(孔徑0.22μm，美國Millipore公司)。

1.3 實驗儀器小動物呼吸麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；tMCAO栓線(北京西濃科技有限公司)；高速組織研磨儀(康濤科技)；激光共聚焦顯微鏡(Zesis公司)；生物分子成像儀(GE公司)；ECL發光儀(GE公司)；2K16型臺式低溫離心機(Sigma公司)；HR-120電子分析天平(A&D公司)；DYY-7C型垂直板電泳轉移裝置及蛋白電泳系統電源(北京六一儀器廠)；Milli-Q plus超純水儀(Millipore公司)。

2 方法

2.1 實驗設計

2.1.1Gas治療缺血性腦卒中的藥理學作用評價 為了檢測Gas是否具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用，將SD大鼠分為6組，每組15只，分別為Sham組、Model組、Model+Gas(25 mg·kg-1)組、Model+Gas(50 mg·kg-1)組、Model+Gas(100 mg·kg-1)組、Model組+Eda(10 mg·kg-1)治療組。各組動物通過tMCAO處理后立即通過尾靜脈注射分別給予生理鹽水，不同劑量的Gas注射液，依達拉奉注射液。3 d后進行神經行為學評分，評分后立即處死大鼠，取腦進行TTC染色，根據染色結果統計各組大鼠梗死率和水腫率評價Gas對腦缺血/再灌注3 d后腦卒中損傷的影響。

2.1.2Gas對缺血性腦卒中相關因子表達的影響 為了探究Gas對缺血性腦卒中相關因子表達的影響，將SD大鼠分為6組，每組6只，分別為Sham組、Model組、Model+Gas(25 mg·kg-1)組、Model+Gas(50 mg·kg-1)組、Model+Gas(100 mg·kg-1)組、Model組+Eda(10 mg·kg-1)治療組，各組動物進行tMCAO模型處理，再灌注后立即通過尾靜脈注射分別給予生理鹽水，不同劑量的Gas注射液，依達拉奉注射液。連續給藥3 d，3 d后各組分別取3只進行灌流取腦，另外3只取缺血側海馬體和皮層組織，用于檢測β-actin、caspase-3、caspase-8、Survivin和HBXIP蛋白的表達。

2.2 實驗動物模型的制備動物模型采用線栓法來制備。大鼠適應1周后，術前禁食12 h，自由飲水。首先放入麻醉箱中麻醉后稱體質量，仰臥位于操作臺上固定四肢，帶上麻醉面罩。用酒精棉潤濕消毒脖頸處皮毛，手術剪小心分開皮下肌肉和脂肪，尖鑷仔細分開并充分暴露出右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)，頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內動脈(internal carotid artery，ICA)；將ECA結扎后并灼斷，用動脈夾夾閉CCA和ICA部位，在ECA灼斷處和活結之間剪一小口，插入線栓到顱腔內，在感覺到有阻力系緊活結，縫合頸部皮膚；缺血60min后剪開皮膚，拔出線栓恢復供血，縫合皮膚完成缺血/再灌注造模實驗。

2.3 大鼠神經行為學評分再灌注3 d后，對各組大鼠進行神經行為學評分，評分方法為Zea Longa’s test法，評分標準如下：0=無障礙；1=不能完全伸展左側前肢；2=向左側轉圈；3=向左側傾倒；4=無自主活動或陷入深度昏迷中。

2.4 TTC檢測大鼠梗死率和水腫率行為學評分結束后，立即用10%水合氯醛麻醉后斷頭取腦，切成6個腦片后置于3%的TTC溶液中，37 ℃下避光孵育15 min后放入4%多聚甲醛溶液中，浸泡24 h后將腦切片按順序排列整齊并拍照保存，用Image-Pro Plus 6.01圖像分析軟件統計每個腦切片的梗死面積，患側面積以及健側面積。腦梗死率/%=梗死面積/(健側面積×2)×100%；水腫率/%=(損傷側面積-健側面積)/(健側面積×2)×100%

2.5 實驗動物灌流取腦每組選取3只大鼠，用10%水合氯醛麻醉(3 mL·kg-1)，仰臥位于解剖臺上，沿著腹部兩邊向上剪，向上拉開胸部皮膚充分暴露出大鼠心臟，將灌注針插入左心室，止血鉗夾緊灌注針和心臟，鑷子挑破右心耳，開始灌注PBS溶液(pH 7.4)，肝臟變白后換成4%多聚甲醛溶液繼續灌注，直到大鼠肝臟變硬，四肢和尾巴僵直且不易彎折后即可取腦，放于4%多聚甲醛溶液中保存備用。

2.6 尼氏染色觀察缺血側神經元形態將灌流后的大腦進行石蠟切片，石蠟切片常規脫蠟后脫水(二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各15 min，然后梯度乙醇脫水：100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、90%、80%、70%各5 min)；蒸餾水沖洗3次，每次5 min；然后置于60 ℃孵箱用焦油紫染色30 s；蒸餾水洗凈染料后，分別置于70%、80%和95%以及100%乙醇中脫水，再用二甲苯透明；最后用中性樹膠封片。正置顯微鏡下觀察拍照，并用Image-Pro Plus 6.01圖像分析軟件分析尼氏體累積光密度值。

2.7 免疫熒光染色檢測Survivin和HBXIP的表達每組取6張石蠟切片，將石蠟切片組織脫蠟，二甲苯15 min×2，梯度酒精進行水化：100%乙醇10 min×2，95%乙醇5 min×1，80%乙醇5 min×1，70%乙醇5 min×1，60%乙醇5 min×1，雙蒸水5 min×2，PBS溶液5 min×3；切片放入抗原修復液中煮沸10 min，自然冷卻至室溫，然后PBS溶液5 min×3；將切片放入含有0.5% Triton X-100(曲拉通)的PBS溶液中，透化10 min后PBS溶液5 min×3；擦干腦組織外的水跡，用組化筆畫圈，滴加50 μl 5%BSA后，在濕盒中室溫下封閉30 min；擦干組織周圍，滴加50一抗Survivin(1 ∶250)和HBXIP(1 ∶250)，4 ℃過夜；取出濕盒復溫30 min，PBST溶液10 min×3；避光條件下，加二抗稀釋液和Hoechst 33342(比例1 ∶1 000)，室溫孵育2 h；PBST溶液10 min×3，90%甘油封片后蓋上蓋玻片，用指甲油封住固定。

2.8 海馬體和皮層蛋白的提取分別稱取海馬體和皮層組織約80 mg，加入800 μL預冷的組織裂解液，超聲破碎儀中勻漿，冰上裂解30 min后于4 ℃ 12 000 r·min-1離心30 min，取上清，取5 μL上清通過BCA法測定蛋白含量，其余上清按比例加入SDS上樣緩沖液并于100 ℃沸水浴中煮沸10 min變性，-80 ℃保存。

2.9 Western blot檢測caspase-3、caspase-8和Survivin、HBXIP蛋白的表達采用SDS-PAGE 凝膠電泳，然后將蛋白轉至PVDF 膜，用5% BSA 封閉2 h 后孵育一抗，加入一抗β-actin(1 ∶5 000)、caspase-3(1 ∶1 000)、caspase-8(1 ∶1 000)、Survivin(1 ∶2 500)、HBXIP(1 ∶2 500)，4 ℃孵育過夜。搖床室溫孵育二抗2 h。PVDF 膜用TBST 洗滌10 min×3次后，加ECL 顯色劑，用凝膠成像系統檢測，以β-actin為內參，分析目的條帶/對應內參的相對表達量。

3 結果

3.1 Gas對tMCAO大鼠梗死率、水腫率以及神經行為學評分的影響如Fig 2所示，Sham組未見梗死區和水腫，無神經功能缺損。當大鼠缺血/再灌注3 d后，相比于Sham組、Model組、缺血側大腦白色梗死區和水腫范圍明顯增加(P<0.01)，神經缺損功能評分增加(P<0.01)；與Model組相比，Gas(50、100 mg·kg-1)和Edaravone(10 mg·kg-1)治療組的大腦梗死率、水腫率和神經行為學評分明顯減少，差異具有顯著性(P<0.01)。

3.2 Gas對tMCAO大鼠神經元形態學損傷的影響如Fig 3A-C所示，Sham組大鼠海馬CA1區和皮層中錐體細胞形態結構完整，排列緊密，胞質核仁清晰，存在大量的神經元；缺血/再灌注3 d后，Model組大腦海馬CA1區和皮層中神經元細胞較少，輪廓模糊不清，尼氏小體明顯減少，細胞排列紊亂(P<0.01)；Gas(50、100 mg·kg-1)和Edaravone(10 mg·kg-1)治療組大腦海馬CA1區和皮層中錐體細胞排列較為緊密，細胞邊界較為清晰，尼氏小體數量增加，神經元密度增加(P<0.01)。

3.3Gas可抑制缺血/再灌注后相關凋亡蛋白的表達如Fig 4 A，B所示，通過蛋白免疫印跡法檢測大腦缺血側海馬CA1區和皮層中caspase-3蛋白表達增加。缺血/再灌注后72 h，與sham組相比,Model組中caspase-3的表達明顯增加；與Model組相比，Gas(50、100 mg·kg-1)和Eda(10 mg·kg-1)藥物治療后海馬CA1區和皮層中缺血側caspase-3蛋白表達減少(P<0.05)；大腦缺血側海馬CA1區和皮層中caspase-8蛋白的表達表現出同樣的趨勢。

3.4 Gas可促進tMCAO大鼠神經元中Survivin和HBXIP蛋白的表達如Fig 5 A所示，通過蛋白免疫印跡法檢測大腦缺血側皮層中Survivin和HBXIP蛋白表達增加。缺血/再灌注后72 h，與sham組相比,Model組中Survivin和HBXIP的表達明顯增加(P<0.05)；與Model組相比，Gas(100 mg·kg-1)和Eda(10 mg·kg-1)藥物治療后缺血側皮層中Survivin和HBXIP蛋白表達增加(P<0.01)。

如Fig 5 B、C所示，免疫熒光染色顯示，相比于Sham組大腦海馬和皮層組織內的Survivin和HBXIP熒光表達水平增加；相比于Model組，Gas給藥組和依達拉奉給藥組Survivin和HBXIP熒光表達增加。其趨勢與Survivin和HBXIP蛋白表達相一致。

Fig 5 Effect of gastrodin on expressions of Survivin,HBXIP in brain of rats induced by tMCAOA: Protein levels of Survivin and HBXIP in brains 72 h after tMCAO in rats B: Immunofluorescence showed the expression of Survivin in hippocampus CA1 and cortex of 72 h after tMCAO in rats; C: Immunofluorescence showed the expression of HBXIP in hippocampus CA1 and cortex of 72 h after tMCAO in rats.#P<0.05 vs sham group,*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

Fig 4 Effect of gastrodin on expressions of caspase-3,caspase-8 in brain of rats induced by tMCAOA: Protein levels of caspase-3 and caspase-8 in hippocampus 72 h after tMCAO in rats; B: Protein levels of caspase-3 and caspase-8 in cortex 72 h after tMCAO in rats vs sham group,*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

Fig 3 Effect of gastrodin against hippocampus CA1 neuronal and cortex neuronal injury in rats with tMCAO

Fig 2 Effect of gastrodin on ischemia-reperfusion injury in tMCAO ratsA: Representative photographs of TTC-stained brain sections; B: Cerebral infarct volume and edema volume examined of rats in each group,and Ldonga's test score to evaluate neurological deficits vs Sham group,*P<0.05,**P<0.01 vs Model group.

4 討論

缺血/再灌注后使大腦出現病理性變化，隨后出現一系列生理改變，包括氧化應激、炎癥反應、細胞程序性死亡等，從而引起神經細胞功能障礙和神經元死亡。有研究發現，Gas可以在分子水平與機體纖維蛋白原結合，可通過血腦屏障，靜脈注射可快速進入大腦，故本實驗選擇尾靜脈注射給藥的方式來探究。研究結果顯示，Gas可明顯減少tMCAO大鼠的神經行為學異常，腦梗死和腦水腫癥狀，表明Gas具有改善缺血/再灌注損傷的作用。

由于腦缺血會導致神經元壞死或凋亡，本研究還觀察了與缺血性腦卒中密切相關的大腦海馬CA1區和皮層神經元損傷情況[10-12]。尼氏小體是神經元合成蛋白的主要場所，其變化能反映神經元功能情況，是神經細胞功能活性的形態指標。當受損神經元功能修復后，已經破碎并逐漸消失的尼氏小體可重新出現。尼氏染色結果顯示，Gas治療明顯增加增加尼氏小體數量，明顯促進神經元功能的恢復。

細胞凋亡是遲發性神經元死亡的主要形式，一般發生在缺血/再灌注3～4 d。當細胞受到刺激時，細胞色素C從線粒體釋放后與凋亡相關因子1(apoptosis protein activating factor，Apaf-1)結合形成多聚體，并促使caspase-9與其結合形成凋亡小體，激活caspase-3，從而誘導細胞凋亡。而激活的caspase-8能間接誘導細胞色素C從線粒體釋放進入胞質，從而把死亡受體通路和線粒體通路聯系起來，有效地擴大了凋亡信號。另外由于酶原形式的pro-caspase-3和pro-caspase-8本身不具備催化活性，故而實驗中通過檢測活化后的caspase-3和caspase-8來表明細胞凋亡的發生。本研究發現，Gas可明顯抑制caspase-3和caspase-8凋亡因子的表達，提示本實驗中，Gas具有抑制細胞凋亡通路激活的功效。

細胞的凋亡不僅僅是凋亡因子表達參與的結果，而是細胞內抗凋亡因子與促凋亡因子表達失衡導致的結果。有文獻顯示，Survivin能夠抑制線粒體中由凋亡蛋白活化因子1結合細胞色素c和活化Pro-caspase-9，酶解Pro-caspase-3 使之激活從而執行的細胞凋亡[13]。Survivin還可通過p21抑制caspase活化而抗凋亡。在神經系統中，2005年有文獻報道從胚胎d 10.5開始進行Survivin的條件敲除，新生小鼠突變體顯示出嚴重的多灶性凋亡，腦體積明顯縮小，表明Survivin對于發育中的中樞神經細胞的存活很重要。當大腦受到缺血/再灌注損傷后，Survivin在神經組織細胞中會大量的表達，而且參與遲發性神經元死亡的過程[14]。而HBXIP作為Survivin分子伴侶，可與Survivin形成復合物，增強Survivin的抗凋亡作用。

HBXIP是一種因可與乙肝病毒X蛋白的C端特異性結合而得名的蛋白質，參與DNA的復制、細胞凋亡、細胞侵襲和轉移等過程，與Survivin結合后可抑制線粒體內源性途徑誘導的凋亡。2017年文獻表示HBXIP和Survivin復合物可拮抗全腦缺血/再灌注后損傷中的神經元凋亡[15]。本實驗通過蛋白質印跡法和免疫熒光染色法觀察發現，Survivin和HBXIP蛋白的表達在Gas治療下得到明顯的提升。表明Gas不僅通過抑制凋亡因子的表達，而且促進抗凋亡因子的表達來實現對缺血性腦卒中神經元的保護作用。

本課題研究進一步闡明Gas對缺血性腦卒中的相關作用機理，有助于豐富和發展缺血性腦卒中發病機制的假說，為尋找新型潛在的抗缺血性腦卒中具有重要的意義。

(致謝：本實驗研究工作在中國醫學科學院藥物研究所藥理實驗室完成，感謝實驗室的老師和同學！)