Ghrelin早期干預改善急性心肌梗死后心肌重構和心臟功能

梅 勇，孫 楠，邢 文，王德國,劉銀華，劉表虎，呂 坤

[皖南醫學院第一附屬醫院(弋磯山醫院)1.老年醫學科、2. 病理科、3. 影像超聲科，4.安徽省高校非編碼RNA轉化研究重點實驗室(中心實驗室)，安徽 蕪湖 241001]

心肌梗死(myocardial infarction，MI)不能及時再灌注可導致慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)，在此過程中心交感神經過度興奮起非常重要的作用。交感神經遞質能夠與心肌細胞β腎上腺素受體(β-adrenergic receptors，β-AR)結合產生心臟毒性，如心肌細胞增生和心臟重構1。CHF不但引起特定基因表達如心鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)，也造成心肌細胞膜β腎上腺素受體表達改變[1- 2]。

Ghrelin是一種28個氨基酸多肽，首次發現在大鼠的胃細胞中。Ghrelin受體生長激素促分泌素受體(GHSR-1a)分布廣泛，參與多種病理生理功能[3]。研究表明補充外源性Ghrelin可以抑制交感神經活性[4]，提高迷走神經興奮性[4-5]，改善心肌缺血[6]，降低多種心肌損傷模型動物的死亡率[7]。因此，Ghrelin有可能減輕心肌缺血并防止其進展為CHF。在本研究中，我們首先建立MI模型，并早期使用合成的外源性Ghrelin連續干預，評價其對缺血大鼠心交感神經活性以及左心室心肌細胞肥大、心肌纖維化、心肌細胞膜β腎上腺素受體表達的影響，從而探索心力衰竭治療的新途徑。

1 方法

1.1 實驗動物及分組30只SD大鼠，體質量(180～210) g，♂,(南京青龍山實驗動物中心，許可證號為：SCXK2018-0001)隨機分成3組：假手術組(Sham組，n=6)；心肌梗死組(MI，n=12)；心肌梗死 + Ghrelin組(MI+Ghrelin組，n=12)。Ghrelin購自于上海生物多肽公司，合成序列：GSS(octanoyl)FLSPEHQRVQQRKESK KPPAKLQP。

1.2 動物模型建立及其干預建立大鼠心肌梗死模型[8-9]，即動物麻醉、固定、氣管插管呼吸機正壓通氣，潮氣量為40 L·g-1,將呼吸頻率調至70次·min-1，呼吸比2 ∶1。開胸暴露心臟，以眼科縫線沿左心耳下緣2 mm穿過冠狀動脈左前降支(LAD)，結扎引起LAD閉塞，Ⅱ導聯心電圖顯示ST段抬高，Sham組僅穿縫線但不結扎。建模成功后，逐層縫合胸腔并排出胸腔內氣體。大鼠清醒后隨后常規飼養，并在術后3 d肌肉注射10萬單位青霉素以防止傷口感染。MI+Ghrelin組給予Ghrelin皮下注射(100 μg·kg-1，每天2次)，連續4周；Sham組和MI組以同等量的容量的生理鹽水注射。

1.3 心臟彩超測定心臟功能術后第5周末，稱體質量并麻醉大鼠，胸部備皮，按文獻報道的方法用高頻超聲探頭測定大鼠心臟功能[8]。根據左心室短軸面測定左室短軸舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVDd)和左室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic dimension，LVDs)，并計算出左室短軸縮短分數(left ventricular fractional shortening，LVFS)以及左室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.4 交感神經放電的測定將麻醉大鼠仰臥位固定，逐層剝離頸部皮膚和肌肉尋找到頸部星狀神經節[10]，其形態為米粒狀半透明結節。玻璃神經分離針分開0.5 ～ 1 cm交感神經束并輕柔剝離外層神經束外膜。以自制鉑絲電極勾住該段交感神經，液體石蠟油滴在神經表面以便與周圍組織電絕緣，連接電生理儀(RM6240多道生理記錄儀，成都儀器廠)并記錄交感神經放電并存儲在微機中。實驗結束后電腦分析交感神經放電情況，根據報道的方法分析交感神經放電幅度以評價交感神經活性(sympathetic nerve activities，SNA)[10]。

1.5 HE染色評估心肌細胞肥厚和心肌纖維化實驗結束后，取心臟標本進行病理學觀察[10]，即經主動脈以4%多聚甲醛逆向灌洗心臟，并切除結扎線下小塊的心肌組織在4%多聚甲醛中固定。隨后常規處理標本并石蠟組織包埋。隨后由病理科專業技術人員進行常規切片，HE和Masson染色。按我們既往方法測定心肌細胞直徑[10- 11]，即于40倍放大光鏡下，每張切片隨機選取10個細胞測量直徑，取平均值作為該切片心肌細胞的直徑；高倍視野下以ImageJ軟件分析心肌梗死面積和非梗死區心肌膠原容積積分(collagen volume fraction，CVF)，CVF/%=心肌膠原面積/所測視野面積×100%。

1.6 蛋白免疫印跡分離心臟蛋白質并以BCA法測定蛋白質濃度[11]，14% SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜上。常規處理后以不同抗體(一抗)在4 ℃下孵育過夜(ANP，BNP和β1-AR，1 ∶1 000，Santa Cruz公司；β2-AR，1 ∶ 2 000，Abbkine公司)，沖洗后再與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1 ∶2 000; Sigma)檢測抗體結合，隨后沖洗，并使用ECL試劑盒顯色，在Quantity One(Bio-Rad)中定量分析。

2 結果

2.1 Ghrelin對心梗后心臟功能的影響大鼠心臟超聲檢查提示心肌梗死后第5周，大鼠LVDs和LVDd增高(LVDs：6.15±0.64 mmvs4.56±0.37 mm；LVDd：7.23±0.85 mmvs4.82±0.57 mm；P<0.01)，而Ghrelin干預可以明顯減輕心肌梗死引起的LVDs和LVDd異常(LVDs：5.37±0.46 mmvs82.1±4.16.15±0.64 mm；LVDd：5.98±0.67 mmvs7.23±0.85 mm;P<0.01 )。MI組大鼠LVEF(46.2%±6.5%vs82.1%±4.1%，P<0.01)和LVFS(20.1%±3.7%vs45.8±4.6%，P<0.01)明顯降低，而Ghrelin干預可以明顯改善心肌梗死引起的LVEF(65.10±3.91vs46.2%±6.5%，P<0.01 )和LVFS(32.00%±3.51%vs20.1%±3.7%，P<0.01)異常。見Fig 1。

Fig 1 Effects of Ghrelin on cardiac function post myocardial infarction by echocardiographic MI=Myocardial infarction; LVDs= left ventricular end-systolic dimension; LVDd= left ventricular end-diastolic dimension; LVEF= left ventricular ejection fraction; LVFS=left ventricular fractional shortening. **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

2.2 Ghrelin對心肌梗死面積及心機纖維化的影響急性心肌梗死后第5周大鼠心臟出現透壁性心肌梗死，Masson染色可見心室前壁全層藍色膠原組織(Fig 2A)， Ghrelin治療可以明顯縮小梗死面積(20.75%±3.54%vs34.4%±4.58%，P<0.01)(Fig 2C)。非梗死區域的心肌區域的心肌組織間隙呈現顯著地膠原增生(Fig 2B)，以CVF定量分析發現MI組比正常組明顯增加(13.17%±2.44%vs2.98%±1.028%，P<0.01)，Ghrelin治療可明顯降低CVF(8.04%±1.52%vs13.17%±2.44%，P<0.01)(Fig 2D)。

Fig 2 Effects of Ghrelin on infarct size and collagen volume fraction (CVF) post myocardial (A) Representative micrographs showing the cross-section of a heart stained with Masson’s staining in heart from Sham，MI and MI+Ghrelin group; (B) Representative amplified field in non-infarct area in different groups. (C) Summary data of infarction size (%); (D) Collagen volume fraction (CVF%) in different groups. MI=Myocardial infarction; **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

2.3 Ghrelin對心梗后心肌細胞肥大的影響如Fig 1所示，高倍鏡下可見清晰觀察到心肌細胞形態及其間質。Sham組心肌細胞形態及大小正常，心肌纖維排列也比較整齊致密。而MI組的心肌細胞呈現增生肥大改變，細胞不夠致密，而且細胞間質增多。MI+Ghrelin組心肌細胞的肥大改善，排列也相對整齊，細胞間質也有所改善。以心肌細胞的直徑作進行定量分析可見，MI組心肌細胞直徑以及MI+Ghrelin組心肌細胞直徑明顯高于Sham組(20.01±1.06vs14.04±0.82，P<0.01)；MI+Ghrelin組直徑明顯小于CHF組(16.24±0.97vs20.01± 1.06，P<0.01)，這種形態學觀察表明早期注射外源性Ghrelin可明顯改善心梗后心肌細胞增生重構。

2.4 Ghrelin對心梗后心衰心肌ANP及BNP蛋白表達的影響心梗后心肌重構可引起多種胚胎蛋白表達，與心肌細胞肥大相關。如Fig 3所示，心梗5周大鼠左心室心肌組織ANP和BNP相對蛋白表達量明顯增加(ANP: 3.84±0.23vs1.05±0.08; BNP:4.48±0.45vs1.09±0.11;P<0.01)；而心肌梗死后早期使用Ghrelin干預可以明顯降低心梗后心肌組織ANP和BNP相對蛋白表達(ANP:1.56±0.18vs3.84±0.23; BNP:2.18±0.32vs4.48±0.45;P<0.01)。這表明早期注射外源性Ghrelin可明顯改善心梗后心肌重構相關蛋白的表達。

Fig 3 Effects of Ghrelin on cardiomyocyte hypertrophy post myocardial infarctionRepresentative micrographs of left ventricular tissue stained with hematoxylin-eosin (HE) staining in heart from Sham (A)，MI (B) and MI+Ghrelin (C) group. (D) Summary data of cardiomyocyte diameter (CMD) in left ventricular MI，Myocardial infarction; **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

2.5 Ghrelin對心梗后心衰大鼠心交感神經活性的影響為明確心梗后心衰大鼠及Ghrelin干預對交感神經功能的影響，通過直接記錄心臟交感神經放電并評估心肌梗死后心交感神經活性。如Fig 3A所見， MI組大鼠在梗死后5周時科記錄到增強的交感神經放電，而MI+Ghrelin組交感神經放電減弱。對交感神經放電強度定量分析顯示，MI 組SNA幅度明顯增高(50.8±5.83vs19.9±3.5，P<0.01)，而Ghrelin干預明顯抑制心肌梗死后心交感神經過度激活(34.3±4.6vs50.8±5.83，P<0.01 )。

2.6 Ghrelin對心梗后心衰大鼠心肌細胞β受體蛋白表達的影響為了明確心衰大鼠及Ghrelin干預對特定腎上腺素受體亞型的影響，以蛋白免疫印跡測定梗死后心肌組織勻漿中β1和β2腎上腺素受體表達。 如Fig 4所示，與Sham組的勻漿相比，MI 組心臟的心室勻漿含β1和β2腎上腺素受體蛋白表達明顯降低(β1-AR: 0.26±0.09vs1.08±0.08; β2-AR：0.43±0.09vs1.15±0.12;P<0.01)，然而Ghrelin干預明顯增加心梗后心臟的心室勻漿含β1和β2腎上腺素受體蛋白表達(β1-AR: 0.96±0.11vs0.26±0.09; β2-AR: 0.89±0.16vs0.43±0.09;P<0.01)。

Fig 4 Effects of Ghrelin on natriuretic peptide expression in left ventricular tissue post myocardial infarctionA: Representative Western blot of BNP，BNP and GAPDH; B: Summary data of BNP and ANP expression relative to ANP：atrial natriuretic peptide；BNP：brain natriuretic peptide. **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

Fig 5 Effects of Ghrelin on cardiac sympathetic activities (SNA) post myocardial infarctionA: Representative trace of cardiac B: Summary data of cardiac SNA in rats from different groups. MI，Myocardial infarction; **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

Fig 6 Effects of Ghrelin on β-adrenergic receptor expression in left ventricular tissue post myocardial infarction(A) Representative Western blot of β1-AR and β2-AR. (B) Summary data of β1-AR and β2-AR expression relative to MI，Myocardial infarction; **P<0.01 vs Sham; ##P<0.01 vs MI group.

3 討論

急性MI后CHF是嚴重威脅人們的生命健康，早期治療是避免或延緩進展為CHF的關鍵。防止和逆轉心臟重構是當前治療的共識，例如抑制交感神經過度激活、阻斷腎素血管緊張素醛固酮系統等是當前CHF治療基石[13]。作為一種內源性氨基酸多肽，Ghrelin參與多種病理生理功能[3]。既往研究顯示，Ghrelin不但能夠保護急性MI大鼠的心臟功能[4]，也能改善MI后期心臟重塑引起的CHF[6]。本研究觀察到MI后5周大鼠左心室內徑擴大，收縮力減弱，Ghrelin治療可以明顯改善MI后心衰大鼠的心臟功能，提示在MI早期使用Ghrelin可能減少后期形成CHF的風險。

心交感神經過度激活是導致心衰進展的重要因素，抑制交感神經活性及阻斷其受體效應可以保護衰竭心臟[13-14]。無論是皮下注射還是腦室內給予Ghrelin治療，均可以抑制急性MI引起的交感神經活性增強，即便切斷了雙側迷走神經，Ghrelin仍能進一步抑制交感神經活性，表明Ghrelin主要通過中樞神經通路抑制交感活性，而迷走神經傳入通路則部分則協同抑制MI誘導的交感神經過度激活[4]。Shirai等[4]發現Ghrelin治療2周可以將MI誘導的血漿甲腎上腺素濃度抑制到與假手術組水平，并降低了實驗動物心率，改善了自主神經功能。Jense等[13]研究表明經外周靜脈使用Ghrelin也可以穿過血腦屏障并作用于腦內的Ghrelin受體，對中樞神經系統產生影響發揮抗抑郁作用。在本研究中，通過直接記錄心交感神經放電活動，實驗觀察到心肌梗死后心衰時交感神經過度激活，心肌梗死早期使用Ghrelin干預可明顯抑制心交感神經活性。表明MI后經靜脈早期Ghrelin治療能夠抑制過度激活的交感神經活性，但其具體的作用機制還不清楚，可能與Ghrelin在中樞和外周神經共同作用的結果。

過度增加的交感神經激素可以與心肌細胞膜β-AR結合產生心肌細胞毒性[14]，并造成β-AR表達的異常[1]。CHF時心肌細胞膜表面的β1-AR表達明顯下調，從而引起G蛋白偶聯受體后信號傳導通路異常，參與CHF的病理生理機制[1]。目前有關Ghrelin與心臟β1-AR相關研究較少，有研究發現急性MI時微小動脈擴張而促進非缺血區的冠狀動脈灌注，β-AR阻滯(普萘洛爾)則抑制了心臟微小血管的擴張，Ghrelin則可以防止β-AR阻滯劑的小血管不良作用。這一研究表明ghrelin可以與常規的β-AR阻斷劑聯合使用，從而協同改善冠狀動脈血流和心臟功能[15]。有研究認為心肌細胞中Ghrelin及其受體(growth hormone secretagogue receptor subtype 1a，GHS-R1a)與β-AR間存在交互作用，Ghrelin對β-AR有增敏效應，Ghrelin可以促進異丙腎上腺素的正性肌力和冠脈擴張效應。本研究發現MI后心衰心臟中β-AR表達下調，Ghrelin早期干預可以防止心肌細胞β-AR的降低。Ghrelin對MI后心肌β-AR的上調作用可能有助于保護缺血心臟的功能。有必要進一步的研究以探討Ghrelin激活GHS-R1a時心臟β-AR的活性變化的具體機制及效應。

MI后心力衰竭可表現為心肌重構和利鈉肽系統的表達升高。二者對心衰病理生理過程有一定代償作用，既能夠增強心臟收縮功能，同時也是心衰發生發展的重要標志[2]。有效的抗心衰治療可以明顯地減輕心肌細胞肥大，也降低心臟和循環中ANP和BNP的水平[2，11]。過去有研究表明Ghrelin可降低MI后心臟膠原增生和左心室肥大。本研究也觀察到,Ghrelin早期干預可以縮小梗死面積、降低非梗死區的膠原增生、減輕MI導致的心肌細胞肥大并降低心肌組織的ANP和BNP蛋白表達。表明Ghrelin可能通過抑制心梗后心臟重塑而發揮心臟保護作用。然而，Ghrelin 抗MI后心肌重塑的機制尚不清楚，可能與Ghrelin抑制交感神經活性有關[6]。

綜上所述，在MI早期Ghrelin干預可以(1)改善心梗后心衰動物的心臟功能；(2)減輕心肌細胞重構和相關基因表達；(3)調節心衰心臟的β腎上腺素受體表達；(4)抑制MI后交感神經過度激活。本研究表明在心肌梗死早期使用Ghrelin可以減輕心梗后心肌重塑并預防心力衰竭，其作用機制可能通過抑制交感神經過度激活并減少腎上腺素心肌毒性實現。