艾葉油對(duì)小鼠肝臟生物鐘基因Bmal1、Clock mRNA時(shí)辰變化的影響

敖 舟 保彩秀 張 露 佟海英 黃先菊*

1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029

艾葉(Artemisiae argyi)是菊科植物艾的干燥葉，廣泛應(yīng)用于治療各種炎癥、疼痛、婦科疾病、胎動(dòng)、月經(jīng)不調(diào)等[1]。在中醫(yī)理論中，“陰”和“陽(yáng)”是用以辨證施治的相對(duì)的哲學(xué)概念。艾葉性溫且干，略有升浮之性[2],屬于“陽(yáng)”性藥；因此，可以用來(lái)調(diào)理“陰”性病癥比如虛弱、衰老等。早在19世紀(jì)，西方科學(xué)家就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)藥物的服藥時(shí)間影響其治療作用，不同類型藥物的最佳給藥時(shí)間也各不相同[3]。現(xiàn)代研究證明，人體的生理變化具有生物周期性，在生物鐘的控制調(diào)節(jié)下，人體的基礎(chǔ)代謝、體溫變化、新陳代謝、血糖含量和激素分泌等功能都具有節(jié)律性和峰谷值，致使藥物在吸收、分布、代謝和排泄等方面也成相應(yīng)改變[4]。因此，正確依據(jù)時(shí)辰給藥，可以實(shí)現(xiàn)以最小劑量，達(dá)到最佳療效，最小毒性的治療效果[5]。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在大量的日節(jié)律基因。其中有些基因參與生物鐘的調(diào)控,這些基因的改變可引起生物節(jié)律的異常，這些對(duì)維持生物體節(jié)律起關(guān)鍵性作用的日節(jié)律基因稱為鐘基因[6]。Clock和Bmal1為鐘基因的轉(zhuǎn)錄提供了最基本的動(dòng)力[7]。在生物鐘基因調(diào)控的輔助環(huán)路-PAR蛋白復(fù)合體與E4BP4蛋白形成的輔助調(diào)節(jié)環(huán)路中：Bmal1和Clock的異源二聚體使DBP基因表達(dá)增加, 增加的DBP使 Bmal1/Clock 對(duì) Per1/2 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的效率增強(qiáng)。相反,E4BP4則使Bmal1/Clock對(duì)Per1/2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的效率下降。因此, 在白天時(shí)，Bmal1/Clock被DBP誘導(dǎo)，從而促進(jìn)Per轉(zhuǎn)錄表達(dá)；而在夜間將近時(shí)，Bmal1/Clock被E4BP4抑制，從而抑制Per轉(zhuǎn)錄表達(dá)[8]。在哺乳動(dòng)物視交叉上核(SCN)中，Clock基因呈微弱的近日節(jié)律，在白天時(shí)量稍多，晚上時(shí)量略少，但是全天的表達(dá)水平相對(duì)比較恒定[9]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究艾葉早晚給藥對(duì)小鼠的生理節(jié)律的影響，分析艾葉精油對(duì)小鼠肝臟Bmal1和Clock生物鐘基因的影響，從而探索其臨床治療時(shí)辰規(guī)律，建議最佳用藥時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 艾葉采自于湖北蘄春市，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院洪宗國(guó)教授鑒定。樣品(NO.S20180530)已存放于藥學(xué)院的植物標(biāo)本室。艾葉精油由本院洪宗國(guó)教授制備[2]，產(chǎn)率約為0.607%～0.953%，其主要成分為萜類化合物及其氧化物的混合物如4-萜烯醇、1，8-桉油腦、樟腦、龍腦等[10](如圖1所示)。臨用前以橄欖油稀釋10倍備用。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)參考臨床安全用量，本研究中給藥劑量為0.5 mL/kg。其他試劑均為分析純。

圖1 艾葉精油中主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 48只昆明小鼠(18～22 g)，♀♂各半，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度(22±2)℃，12 h光照循環(huán)的房間中。將小鼠隨機(jī)分為8組，每組♀♂各3只。選取不同的時(shí)間，連續(xù)7 d腹腔注射給藥，在此期間，觀察記錄小鼠的臨床表現(xiàn)，并持續(xù)記錄小鼠的體重變化。最后一次給藥后，分別在10:00和22:00處死小鼠，取肝臟組織約50～100 mg放入Trizol液中低溫凍存。具體實(shí)驗(yàn)方案如圖2所示。

A1：雌雄各半，10:00給藥,10:00取樣；A2：雌雄各半，10:00給生理鹽水，10:00取樣；A3：雌雄各半，22:00給藥，10:00取樣；A4：雌雄各半，22:00給生理鹽水，10:00取樣；B1：雌雄各半，10:00給藥，22:00取樣；B2：雌雄各半，10:00給生理鹽水，22:00取樣；B3：雌雄各半，22:00給藥，22:00取樣；B4：雌雄各半，22:00給生理鹽水，22:00取樣。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 法檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 方法，以β-actin作為參照基因，檢測(cè)Bmal1、Clock生物鐘基因的相對(duì)表達(dá)水平。Trizol試劑從細(xì)胞中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Master Mix10 μL 分別為 PrimerScript RT Enzyme Mix I(1.0 μL)、 RT Primer Mix×4(1.0 μL)、5×PrimeScript Buffer 2(for Real-time)(4.0 μL)、RNase Free dH2O(4.0 μL)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的總體積為 20 μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，取 cDNA 2μL，TB Green Primix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各 0.8 μL，Rox Reference Dye or DyeⅡ(50×)0.4 μL，PCR 反應(yīng)總體積為 20 μL。使用以下擴(kuò)增體系進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增：Stage1 中先將 DNA 聚合酶在 95 ℃預(yù)熱變性 30 s，Stage2 在循環(huán)體系 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～40 s中循環(huán) 40 次。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR相關(guān)引物列表

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用Graphpad-prism-8.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究結(jié)果以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察 整個(gè)給藥過(guò)程中至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組小鼠均活動(dòng)正常，體重呈穩(wěn)步增加的趨勢(shì)(數(shù)據(jù)未顯示)。在給與艾葉油后，部分小鼠出現(xiàn)給藥部位暫時(shí)局部刺激癥狀，但一般在給藥后兩天內(nèi)消失，且無(wú)異常表現(xiàn)。

2.2 艾葉油可顯著上調(diào)Bmal1、Clock基因mRNA表達(dá) 對(duì)照組小鼠Bmal1、Clock基因mRNA早晚表達(dá)比較平穩(wěn)，與上午10∶00對(duì)比，晚上22∶00的Bmal1基因水平約為其0.85倍；Clock基因水平約為其1.11倍。艾葉油對(duì)Bmal1和Clock基因的影響效果基本一致。從圖3和圖4中可以看出，艾葉油可顯著上調(diào)Bmal1、Clock基因mRNA表達(dá)，且上午給藥比晚上給藥mRNA相對(duì)表達(dá)水平更高。表明艾葉油此類“助陽(yáng)”藥的最佳給藥時(shí)辰為上午。

圖3 艾葉油對(duì)Bmal1基因 mRNA表達(dá)的影響注：與對(duì)照組相比，*P<0.05、**P<0.01；兩組之間相比，#P<0.05、##P<0.01。

圖4 艾葉油對(duì)Clock基因 mRNA表達(dá)的影響注：與對(duì)照組相比，*P<0.05、**P<0.01；兩組之間相比，#P<0.05、##P<0.01。

2.3 雌雄之間Bmal1和Clock基因mRNA的表達(dá)差異 為了進(jìn)一步探討性別對(duì)生物鐘基因的影響，雌雄Bmal1和Clock基因 mRNA表達(dá)比例將與對(duì)照組相比。從圖5和圖6中可以看出，上午給藥的雄雌鼠Bmal1和Clock基因mRNA表達(dá)比例更高，差異更顯著；晚上給藥的雄雌鼠mRNA表達(dá)差異較小。表明艾葉油上午用藥對(duì)機(jī)體生物鐘基因的擾動(dòng)較大，且艾葉油對(duì)不同性別的動(dòng)物生物鐘基因的調(diào)控有一定程度的差異，雄性比雌性對(duì)艾葉油更敏感。

圖5 艾葉油對(duì)雄/雌之間Bmal1基因mRNA表達(dá)差異的影響注：與對(duì)照組相比，*P<0.05、**P<0.01。

圖6 艾葉油對(duì)雄/雌之間Clock基因mRNA表達(dá)差異的影響注：與對(duì)照組相比，*P<0.05、**P<0.01。

3 討論

生物的生命活動(dòng)受晝夜節(jié)律的影響，生物的許多生理功能都具有明顯的晝夜節(jié)律。人體生理節(jié)律引起的體內(nèi)藥物濃度變化與藥物的治療效果密切相關(guān)[11]。生物鐘核心基因Bmal1和Clock是哺乳動(dòng)物生命活動(dòng)中最重要的中央時(shí)鐘元件之一，其突變可引起生物節(jié)律系統(tǒng)紊亂，甚至導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生[12]。疾病的發(fā)生和臨床用藥都與晝夜節(jié)律有關(guān)。許多疾病都有晝夜波動(dòng)，如哮喘、心絞痛、胃酸分泌、偏頭痛、癲癇、癌癥、關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病。另一方面，疾病的晝夜節(jié)律也會(huì)引起治療藥物的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的晝夜節(jié)律變化[13]。根據(jù)晝夜節(jié)律，定時(shí)給藥是中醫(yī)時(shí)間療法的特點(diǎn)之一。中國(guó)古人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在自然環(huán)境周期性變化的影響下，會(huì)發(fā)生人體陰陽(yáng)的消長(zhǎng)晝夜變化[14]。因此，應(yīng)根據(jù)晝夜節(jié)律增減藥物，以達(dá)到最佳效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，艾葉油給藥可以促進(jìn)小鼠生物鐘核心基因Clock、Bmal1的表達(dá)，從而改變小鼠的晝夜節(jié)律。在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)生物鐘基因Clock、Bmal1的晝夜節(jié)律有明顯不同的影響。在10∶00給藥比在22∶00點(diǎn)給藥mRNA相對(duì)表達(dá)量更高，說(shuō)明小鼠在早上對(duì)艾葉油更敏感，藥效更好。本實(shí)驗(yàn)充分驗(yàn)證了白天是服用助陽(yáng)藥藥效最佳時(shí)辰的理論，即艾葉油在早上使用效果更好。按照中醫(yī)理論，白天9點(diǎn)到13點(diǎn)之間是陽(yáng)氣最盛的時(shí)候，疾病在病人的抵抗力的幫助下更容易治愈[15]。因此，只有在用藥時(shí)機(jī)與機(jī)體節(jié)律變化相一致的情況下，才能充分調(diào)動(dòng)機(jī)體的積極免疫因素，提高藥物療效，甚至減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

此外，不同性別對(duì)藥物的反應(yīng)性也有所不同。本研究表明，艾葉油對(duì)雌性和雄性小鼠的生物鐘基因表達(dá)水平有一定程度的差異。雄性小鼠對(duì)艾葉油的敏感性略微高于雌性小鼠，對(duì)臨床用藥具有一定的參考意義。

4 結(jié)論

綜上所述，艾葉油可以促進(jìn)小鼠Bmal1、Clock生物鐘基因的表達(dá)，其早晚給藥對(duì)生物鐘基因影響具有顯著不同，且具有性別差異，可為其臨床應(yīng)用提供理論參考。