大蒜粉薄層色譜鑒別方法的建立

鄧麗娟 劉睿婷 胡小霞 黃 瓊 李新霞

1.新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，新疆 烏魯木齊 830013 2.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011

大蒜(AlliumsativumL.)是世界公認(rèn)的藥食兩用植物，也是為數(shù)不多以鮮品形式收錄于中國(guó)藥典的藥材，能解毒消腫、殺蟲(chóng)、止痢，用于癰腫瘡瘍、疥癬、肺癆、頓咳、泄瀉、痢疾等疾病治療[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明大蒜功效成分具有抗感染[2]、抗腫瘤[3]、防治心腦血管疾病[4]、保護(hù)肝臟[5]、提高機(jī)體免疫力[6]、降三高[7-8]等作用。但是新鮮大蒜保質(zhì)期太短，即使存放在2～8 ℃的冷庫(kù)中超過(guò)10個(gè)月也會(huì)變質(zhì)。文獻(xiàn)研究證實(shí)將新鮮大蒜冷凍干燥，加工成蒜片或蒜粉，在冷庫(kù)中可保質(zhì)5年以上，有較強(qiáng)的蒜辣味，且殺菌的效果與新鮮大蒜一致[9]。由于大蒜凍干粉具有：制備工藝簡(jiǎn)單、零添加、生產(chǎn)成本低、儲(chǔ)存運(yùn)輸方便，尤其是完整的保留大蒜的功效成分等優(yōu)勢(shì)，被美國(guó)藥典[10]、英國(guó)藥典[11]和歐盟藥典[12]收錄作為膳食補(bǔ)充劑，而中國(guó)藥典僅收錄大蒜藥材標(biāo)準(zhǔn)，缺少大蒜粉這一品種，嚴(yán)重限制了大蒜藥用及保健制劑的開(kāi)發(fā)。因此，急需建立大蒜粉相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為制備安全、有效、質(zhì)量可控的大蒜類保健食品和藥品提供科學(xué)依據(jù)。

世界公認(rèn)大蒜的活性成分是蒜酶催化蒜氨酸產(chǎn)生的大蒜辣素，大蒜辣素極不穩(wěn)定，可進(jìn)一步分解產(chǎn)生系列含硫化合物[13]。蒜氨酸是大蒜辣素的前體物質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，美國(guó)藥典以蒜氨酸和甲硫氨酸作為大蒜粉的薄層鑒別成分，英國(guó)藥典和歐盟藥典大蒜粉的薄層鑒別以丙氨酸替代蒜氨酸，現(xiàn)有文獻(xiàn)僅報(bào)道了大蒜原藥材、有效部位蒜氨酸薄層鑒別方法[14-16]，對(duì)大蒜粉薄層鑒別方法的研究鮮有報(bào)道。本研究參考美國(guó)藥典、歐盟藥典、英國(guó)藥典大蒜粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)，建立大蒜粉薄層鑒別方法，為大蒜粉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平(AB135-S，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司)，硅膠G薄層板(青島海洋化工分廠，德國(guó)Merk公司，安徽良臣硅源材料有限公司)。

1.2 試藥 甲醇(分析純，天津百世化工)、正丁醇(分析純，天津永晟精細(xì)化工)、正丙醇(分析純，西安化學(xué)試劑廠)、冰乙酸(分析純，天津富宇精細(xì)化工)、無(wú)水乙醇(分析純，天津富宇精細(xì)化工)、茚三酮(分析純，上海試劑三廠)。

蒜氨酸對(duì)照品(批號(hào)AL080428，新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司)。

大蒜粉為來(lái)自不同產(chǎn)地的大蒜鱗莖經(jīng)去皮，切碎、真空冷凍干燥加工制成，其中Y201811001批次來(lái)源于新疆皮山縣桑珠鄉(xiāng)，Y201811004、Y201811005和2018110006來(lái)源于新疆皮山縣克里昂鄉(xiāng)，Y201904003批次來(lái)源于新疆吉木薩爾縣，Y201901021批次來(lái)源于新疆且末縣。生產(chǎn)加工方為新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 取蒜氨酸對(duì)照品適量，加50%甲醇溶液制成每1mL含1mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取1 g大蒜粉，加甲醇5 mL，振搖，靜置，取上清液即得。

2.1.3 茚三酮溶液的配制 顯色劑1(英國(guó)/歐盟藥典)：精密稱取適量茚三酮，加冰乙酸—丁醇=5∶95溶液溶解，制成2 g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇，5∶95)。

顯色劑2(美國(guó)藥典)：精密稱取適量茚三酮，加正丁醇-2 moL/L冰乙酸=19∶1溶液溶解，制成0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 mol/L冰乙酸溶液，19∶1)。

顯色劑3：精密稱取適量茚三酮，加無(wú)水乙醇溶解，制成2 g/L茚三酮無(wú)水乙醇溶液。

2.3 薄層色譜條件優(yōu)選

2.3.1 供試品制備方法考察 分別按照三種方法制備供試品溶液：

①歐盟藥典供試品溶液制備： 取1 g大蒜粉，加甲醇5 mL，振搖60 s，濾過(guò)，作為供試品溶液1。

②美國(guó)藥典供試品溶液制備：取1 g大蒜粉，加甲醇-水(1∶1)20 mL，超聲10 min，離心(轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/min)10 min，取上清液，沉淀加甲醇-水(1∶1)20 mL，再超聲10 min，合并兩次上清液，濃縮至5 mL，作為供試品溶液2。

③課題組方法供試品溶液制備：取1g大蒜粉，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇20 mL溶解，超聲10 min，離心(轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/min)10 min，取上清液，作為供試品溶液3。

分別取對(duì)照品溶液和上述供試品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰，檢視，如圖1所示。結(jié)果表明：三種方法制備的供試品溶液主斑點(diǎn)與對(duì)照品溶液斑點(diǎn)的顏色、位置相同，均有較好的分離度，故供試品溶液制備方法選擇操作簡(jiǎn)單的歐盟藥典方法。

從左到右依次為：對(duì)照品溶液、供試品溶液1、供試品溶液3、供試品溶液2圖1 不同供試品制備方法比較

2.3.1 展開(kāi)系統(tǒng)選擇 吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μL，點(diǎn)于同一薄層板上，分別以冰乙酸-丙醇-水-無(wú)水乙醇(1∶1∶1∶2)、正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1)、正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，再噴氨基酸專屬顯色劑0.2%茚三酮乙醇溶液，在105℃加熱，蒜氨酸斑點(diǎn)均清晰可見(jiàn)，如圖2所示。采用冰乙酸-丙醇-水-無(wú)水乙醇(1∶1∶1∶2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，對(duì)照品溶液與供試品溶液Rf(0.7)值較大，且分離度較差；采用正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1)和正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，對(duì)照品溶液與供試品溶液Rf(0.43-0.48)值適中，分離度均良好，確定配制方法簡(jiǎn)單、使用有機(jī)溶劑種類少的正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為最佳展開(kāi)系統(tǒng)。

A B C左：對(duì)照品溶液；右：供試品溶液A.冰乙酸-丙醇-水-無(wú)水乙醇(20∶20∶20∶40)；B.正丁醇-正丙醇-冰乙酸-水(3∶1∶1∶1)；C.正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)圖2 展開(kāi)劑考察結(jié)果

A B C左：對(duì)照品溶液；右：供試品溶液A.2g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇，5∶95)；B.0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 mol/L冰乙酸溶液，19∶1)；C.0.2%茚三酮無(wú)水乙醇溶液圖3 顯色劑考察結(jié)果

2.3.2 顯色劑的選擇 吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μL，點(diǎn)于同一薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，分別噴以2 g/L茚三酮溶液(冰乙酸-丁醇，5∶95)、0.2%茚三酮溶液(正丁醇-2 moL/L冰乙酸溶液，19∶1)、0.2%茚三酮乙醇溶液三種顯色劑，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顏色清晰，檢視，如圖3所示。結(jié)果表明，三種顯色劑均可使主斑點(diǎn)顯色清晰，故選擇制備方法簡(jiǎn)單，使用有機(jī)溶劑種類最少的課題組方法，即0.2%茚三酮無(wú)水乙醇溶液為顯色劑。

從左到右依次為：對(duì)照品溶液3 μL、5 μL、7 μL，供試品溶液3 μL、5 μL、7 μL圖4 點(diǎn)樣量考察結(jié)果

2.3.3 點(diǎn)樣量的選擇 吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各3 μL、5 μL和7 μL，點(diǎn)于同一薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮無(wú)水乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，立即檢視，如圖4所示。結(jié)果顯示：對(duì)照品溶液和供試品溶液點(diǎn)樣量在3～7 μL范圍內(nèi)，各斑點(diǎn)清晰，且分離度較好，故選擇點(diǎn)樣量為均為5 μL。

2.4 耐用性考察

2.4.1 不同廠牌薄層板的考察 吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于三個(gè)不同廠家生產(chǎn)的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，立即檢視，如圖5所示。結(jié)果顯示：三種硅膠G薄層板分離效果良好，表明該色譜條件耐用性良好。

2.4.2 不同溫度考察 吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開(kāi)劑，分別于4 ℃、20 ℃、35 ℃展開(kāi)，取出，晾干，噴以0.2%茚三酮無(wú)水乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顏色清晰，立即檢視，如圖6所示。結(jié)果顯示：20 ℃和35 ℃，供試品薄層色譜分離效果良好，但在4 ℃主斑點(diǎn)與雜質(zhì)斑點(diǎn)未完全分離，分離效果稍差一些，表明在20～35 ℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)薄層色譜鑒別影響較小。

A B C左：對(duì)照品溶液，右：供試品溶液A.青島海洋；B.安徽良臣；C.德國(guó)默克圖5 不同廠家硅膠板考察結(jié)果

A B C左：對(duì)照品溶液；右：供試品溶液A.4 ℃；B.20 ℃；C.35 ℃圖6 不同溫度考察結(jié)果

2.4.3 不同相對(duì)濕度考察 在雙側(cè)展開(kāi)缸的一側(cè)分別加入適當(dāng)濃度的硫酸溶液，得到相對(duì)濕度分別為RH42%、RH65%、RH88%的環(huán)境[1]。取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一薄層板，放在另一側(cè)槽中，密閉放置30 min左右，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)展開(kāi)，取出，晾干，以2 g/L茚三酮無(wú)水乙醇溶液顯色，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰，置日光下檢視，如圖7所示。結(jié)果顯示：濕度對(duì)蒜氨酸對(duì)照品與供試品的分離度并未產(chǎn)生影響。

A B C左：對(duì)照品溶液；右：供試品溶液A.RH 42%；B.RH 65%；C.RH 88% 圖7 濕度對(duì)分離度影響

2.5 不同批次大蒜粉的薄層鑒別 按上述實(shí)驗(yàn)確定的色譜條件，對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地大蒜加工的六批次大蒜粉進(jìn)行薄層鑒別，如圖8所示，結(jié)果顯示：在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的位置，供試品顯示相同顏色斑點(diǎn)，不同產(chǎn)地大蒜制得的大蒜粉色譜圖一致。

從左到右依次為：蒜氨酸對(duì)照品；大蒜粉Y201811001；大蒜粉Y201901021；大蒜粉Y201904003；大蒜粉Y201811004；大蒜粉Y201811005；大蒜粉Y201811006圖8 點(diǎn)樣量考察結(jié)果

3 討論

本研究參照美國(guó)藥典、英國(guó)藥典、歐盟藥典及相關(guān)文獻(xiàn)，建立大蒜粉薄層鑒別方法，確定以蒜氨酸為對(duì)照品，以甲醇為提取溶劑制備供試品溶液，點(diǎn)樣量5 μL，正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶1)為展開(kāi)系統(tǒng)，以2 g/L茚三酮無(wú)水乙醇溶液為顯色劑，105 ℃下加熱至斑點(diǎn)清晰，置日光下檢視。與美國(guó)藥典、英國(guó)藥典及歐盟藥典大蒜粉薄層鑒別方法相比，新建方法具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：①英國(guó)藥典和歐盟藥典以丙氨酸替代蒜氨酸做標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而本研究方法以功效成分蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為對(duì)照品，專屬性更強(qiáng)，達(dá)到準(zhǔn)確鑒別供試品的目的；②新建方法中供試品制備方法參照歐盟藥典，操作簡(jiǎn)便快速，而美國(guó)藥典及文獻(xiàn)方法中供試品制備方法復(fù)雜，提取時(shí)長(zhǎng)達(dá)3 h，不能滿足薄層色譜鑒別快速和簡(jiǎn)便的要求；③展開(kāi)劑配制方法最簡(jiǎn)單，且色譜斑點(diǎn)分離效果比歐盟藥典的方法好。

本研究中的大蒜粉為來(lái)自不同產(chǎn)地的大蒜經(jīng)切碎、真空冷凍干燥等工藝加工制得，對(duì)多批次大蒜粉進(jìn)行薄層鑒別(僅列出6批薄層鑒別圖譜)，結(jié)果顯示各批次供試品色譜圖在與對(duì)照品相應(yīng)位置，顯相同顏色斑點(diǎn)，且各批次樣品的色譜圖具有較高相似度，揭示大蒜粉生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，且不同產(chǎn)地大蒜中氨基酸的組成差異不大。

4 結(jié)論

本研究建立的薄層色譜鑒別方法具有操作簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，為控制大蒜粉的生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品質(zhì)量提供簡(jiǎn)便易行的檢測(cè)手段，確保以大蒜粉為原料的保健食品和藥品質(zhì)量可控。