長鏈非編碼RNA（AC073934.6）慢病毒質粒構建及其對HEY 和HeLa 細胞系SND1 表達的影響

扈利紅，邱寶晨，辛靈彪，張緯

（天津醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系，天津300070）

非編碼RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）是一種不編碼蛋白質的RNA，通常按照其核苷酸的數量分為兩類，其中長度小于200個核苷酸的稱為小ncRNAs，包括微小RNAs（miRNAs）、短干擾RNAs（siRNAs）和小核仁RNAs（snoRNAs）等，而長度大于200個核苷酸的則稱為長鏈非編碼RNA（lncRNAs）。近幾年的研究發現lncRNAs 在胞核和胞漿里均有功能[1]。在胞核里lncRNA 可以起到招募轉錄相關蛋白并識別DNA 的作用；在胞漿里通過吸附小miRNAs避免其與mRNA 結合，進而間接影響mRNA 的穩定性[2]。因此lncRNA 可以參與許多的生命活動以及疾病的發生和發展[3-5]。

長鏈非編碼RNA AC073934.6（lncRNA-AC）是最近被鑒定出的一個不編碼蛋白質的轉錄產物。它位于人的7 號染色體q32.1 區，長7328 bp，包含3個長度分別為340 bp、112 bp、43 bp 的外顯子，但目前尚沒有對其功能的研究。SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白是一個保守的多功能蛋白，前期的研究已表明，SND1 在基因轉錄、mRNA 剪切、mRNA 穩定性等方面發揮重要作用，進而參與細胞分化和腫瘤細胞的增殖和轉移[6-10]。近期研究發現SND1 在卵巢癌中高表達，并能促進卵巢癌細胞的轉移[11]。但目前為止，對于SND1 本身的表達調控機制尚不清楚。LncRNA-AC 與SND1 基因在基因組上的位置靠近，因此lncRNA-AC 可能會通過調控SND1 進而參與腫瘤的增殖和轉移。本研究利用同源重組的方法構建了真核pLVX-lncRNA-AC重組質粒，并在HEY 和HeLa 兩種細胞系中成功表達，探討lncRNA-AC 與SND1 的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 慢病毒質粒載體pLVX-IRESPuro、包裝質粒pMD2.G、包裝質粒psPAX2 由天津醫科大學生物化學與分子生物學系石磊教授饋贈；DH5α 感受態大腸桿菌E.coli（BC102）購自博邁德生物公司；人腎上皮細胞293T、人卵巢癌細胞HEY、人宮頸癌細胞Hela 均來自本實驗室。

1.1.2 實驗試劑 限制性內切酶XhoⅠ（FD0694）和XbaⅠ（FD0684）、BCA 蛋白測定試劑盒（#SA242678）、revert aid first strand cDNA synthesis kit（K1622）均購自Thermo Fisher Scientific 公司；primestar? max DNA polymerase（R045A） 和primestar?gxl DNA polymerase（R050Q）購于Takara 公司；genbuildertmcloningkit（L00701）購自GenScript；去內毒素質粒提取試劑盒（PD1222-01）購自Biomiga；DNA 快速凝膠回收試劑盒（28704）購自QIAGEN；tripureisolationreagent（11667165001）購自Roche；trans 2K DNA marker（BM101-01）購于北京全式金公司。多克隆鼠源抗SN4 抗體為本實驗室制備；辣根過氧化物酶標記的抗鼠源IgG 二抗（120495）購自KPL；LumiGLo化學發光底物（D0018-2）購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 數據庫查找lncRNA-AC 與SND1 在基因組上的位置關系 打開UCSC 數據庫（http://genome.ucsc.edu/）搜索SND1 與lncRNA-AC 的位置關系。

1.2.2 目的片段的獲取 收集1×106個卵巢癌細胞HEY，提取細胞基因組DNA。根據lncRNA-AC 以及真核表達質粒pLVX-IRES-Puro 的基因序列，設計出針對lncRNA-AC exon1 和exon2 的引物（F1+R1、F2+R2），并將化學合成的第3個外顯子作為引物（F3+R3）（表1），引物由金唯智生物科技有限公司合成。利用同源重組的方法（圖1），以基因組DNA為模板，F1+R1 為引物，擴增出含第1個外顯子的DNA 片段（F1R1）；同時，通過巢式PCR 獲得第2個外顯子，首先以F2+R3 為引物，擴增出lncRNA-AC中包括第2個和第3個外顯子的DNA 片段（F2R3），再以F2R3 為模板，F2+R2 為引物，擴增出含第2個外顯子的DNA 片段（F2R2）。然后將化學合成的第3個外顯子的DNA 片段（F3R3）單鏈經過退火變成雙鏈。利用重疊延伸PCR，以上述3個DNA 片段為模板，F1+R3 為引物，獲得目的基因（F1R3）。

1.2.3 載體與目的基因的體外連接及陽性克隆的鑒定 使用去內毒素質粒提取試劑盒提取pLVXIRES-Puro 載體，進行XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切，膠回收酶切產物，把酶切產物和目的片段進行同源重組。同源重組的總反應體系是20 μL，加入目的基因、線性化的載體、同源重組試劑GenBuilder 2× Master Mix 和ddH2O。反應條件是50℃連接15 min。

表1 LncRNA-AC 的引物序列Tab 1 Primer sequences for lncRNA-AC

圖1 LncRNA-AC 質粒構建示意圖Fig 1 Schematic diagram of lncRNA-AC plasmid construction

重組后的產物轉化至感受態大腸桿菌DH5α中，將菌液涂在含氨芐青霉素的LB 平板上，37℃過夜培養。挑取單克隆，用F1+R3 引物做菌落PCR，篩選在525 bp 左右有條帶的陽性菌落，大量培養，一部分菌液送金唯智生物科技有限公司進行測序鑒定，另一部分提取質粒保存備用。

1.2.4 HEY、HeLa 細胞lncRNA-AC 穩定株的構建及鑒定 包裝質粒pMD2.G、包裝質粒psPAX2 與重組質粒按照3.95 μg：7.3 μg：11.25 μg 混勻，利用聚乙烯亞胺（PEI）共轉染至融合率為70%的293T 細胞中，分別在24 h、48 h 收集病毒液并用0.45 μm濾器過濾。

待HEY、HeLa 細胞的融合率達到60%，加入9 mL病毒液，1 mL 胎牛血清和75 μg polybrene。感染48 h后更換新培養基并加入1 μg/mL 嘌呤霉素進行篩選，陽性細胞即為穩定株。取1×106穩定株細胞，用TRIzol 法提取總RNA，分別取3 μg 逆轉錄為cDNA，用PCR 法檢測lncRNA-AC 的表達，實時熒光定量PCR檢測SND1 的mRNA 水平，引物如下（表2）。同時用10 cm 皿培養細胞，隨后提取總蛋白檢測蛋白濃度，經8%SDS-PAGE，檢測感染lncRNA-AC 之后SND1蛋白水平變化情況。

表2 LncRNA-AC 和SND1 的qPCR 引物序列Tab 2 qPCR Primer sequences for lncRNA-AC and SND1

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism7 進行統計分析。計量資料以±s 表示，組間比較采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA-AC與SND1在基因組上的位置關系 通過數據庫發現，lncRNA-AC 的轉錄起始位點和SND1 的轉錄起始位點之間僅有168 bp，與SND1轉錄方向相反，AC073934.6 位于SND1 基因反義鏈（圖2）。

2.2 LncRNA-AC 基因片段獲取 以基因組DNA為模板，成功獲得lncRNA-AC 的基因片段F1R1、F2R2 和F1R3（圖3）。

圖2 LncRNA-AC 和SND1 基因的位置關系Fig 2 Positional relationship of lncRNA-AC and SND1

圖3 LncRNA-AC 的目的片段Fig 3 Target fragment of lncRNA-AC

2.3 載體與目的基因的體外連接及陽性克隆的鑒定 采用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切pLVX-IRES-Puro得到線性化的載體，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及回收（圖4）。

圖4 線性pLVX-IRES-Puro 質粒載體的獲取Fig 4 Acquisition of linear pLVX-IRES-Puro plasmid vector

菌落PCR 結果顯示，1 號克隆含有陽性重組質粒（圖5）。測序結果顯示重組質粒的序列與lncRNA-AC 序列完全一致（圖6）。這些結果表明pLVXIRES-lncRNA-AC 質粒構建成功。

圖5 菌落PCR 篩選陽性重組體Fig 5 Bacterial PCR screening for positive recombinants

2.4 HEY、HeLa 細胞lncRNA-AC 穩定株的構建及SND1 表達量的測定 普通PCR 擴增lncRNA-AC，經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定lncRNA-AC 在細胞中成功轉錄（圖7）。

圖6 重組質粒lncRNA-AC 的測序結果Fig 6 Sequencing results of recombinant plasmid lncRNA-AC

圖7 過表達lncRNA-AC 穩定株的PCR 結果Fig 7 PCR of lncRNA-AC overexpressing stable strain

在HEY 和HeLa 細胞中，通過Western 印跡檢測，lncRNA-AC 的過表達幾乎不影響SND1 的蛋白質水平（圖8A）。同時，利用實時PCR 檢測了HEY和HeLa 細胞中過表達lncRNA-AC 后SND1 的mRNA 水平。在HEY 細胞系中，WT 和過表達lncRNA-AC 后SND1 的mRNA 相對表達量分別為1.00±0.14 和1.24±0.19，差異無統計學意義（t=1.761，P=0.07）；在HeLa 細胞系中，兩者的表達量分別為1.02±0.09 和0.83±0.13（t=2.081，P=0.14），差異無統計學意義（圖8B）。

圖8 LncRNA-AC 不影響SND1 的表達Fig 8 LncRNA-AC does not affect the expression of SND1

3 討論

本研究采用了多種PCR 衍生技術成功構建了重組質粒lncRNA-AC。為了獲得特異的F2R2，采用了巢式PCR。巢式PCR 的目的是使用兩對PCR 引物擴增特異的片段。第一對PCR 引物又稱外側引物，擴增相對大的區域；第二對引物稱為巢式引物結合在第一次PCR 產物內部，從而獲得特異性的目的片段。其次，采用了重疊延伸PCR 將lncRNA-AC的3個外顯子片段（F1R1、F2R2 和F3R3）連接起來。重疊延伸PCR 可作為位點定向突變的手段，為目的基因引入所需的突變[12-13]。最終，通過同源重組的方法把lncRNA-AC 的編碼片段和線性化載體連接起來。同源重組構建質粒的關鍵是每個DNA 片段（包括克隆載體）末端需含有一個15～40 bp 的共享同源序列作為同源臂，含有相同同源臂的兩個片段可以在重組酶的作用下特異性連接。因此，同源重組是目前高效快速構建質粒的策略[14-15]。在本次研究中，通過巢式PCR、重疊延伸PCR 和同源重組法成功構建了lncRNA-AC 的慢病毒質粒。

LncRNA-AC 與SND1 的轉錄起始位點只相差168 bp，且轉錄方向相反，它們共用了一段轉錄啟動序列。但是，在HEY 和HeLa 細胞中過表達lncRNA-AC 并不影響SND1 的表達。提示在卵巢癌細胞系中lncRNA-AC 可能不會形成二級結構招募蛋白并結合至SND1 的啟動子去影響SND1 的表達。LncRNA-AC 在HEY 細胞和HeLa 細胞中幾乎不表達，但SND1 的表達量均比較高。這可能是由于lncRNA-AC 與SND1 的轉錄方向相反，發生轉錄碰撞，隨后SND1 的轉錄活性占主導所致。然而有趣的是，在數據庫中發現lncRNA-AC 和SND1 均在肝、垂體和睪丸等中高表達。提示在肝、垂體和睪丸中可能存在著不同于細胞系中的組織特異性的表達調控機制。但是，目前還沒有在小鼠基因組中找到人源lncRNA-AC 的同系轉錄本或者轉錄類似物。因此需要繼續在人源的肝細胞系中探討lncRNAAC 與SND1 的表達關系。