基因表達譜分析肝細胞癌的特征基因

張萃萃，鄧為民

（1.天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津300070；2.天津市血液中心發血科，天津300110）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌中最常見的原發性惡性腫瘤，占肝癌病例的75%～85%[1]。在世界范圍內每年約有841000例HCC 新增病例和782000例死亡病例[2]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）是導致HCC 發展的重要原因[3]。病毒誘導的發病機制涉及多種機制，例如HBV-DNA 整合進入宿主遺傳系統、DNA 甲基化以及氧化應激[4-5]。肝臟慢性疾病是由于病毒通過各種受體介導的機制持續進入宿主細胞而導致的，這些機制包括感染免疫防御控制中心、病毒抑制抗原呈遞、選擇性免疫抑制、病毒基因表達下調和病毒突變能夠通過識別HBV 抗原使病毒特異性T 細胞功能失效等[6]。盡管HBV 和HCV 引起的病毒性肝炎與HCC 高度相關，但仍有一些非病毒因素可誘發HCC 的發生和發展，如糖尿病、酒精濫用、心血管疾病、肝臟炎癥、肥胖、血脂異常和非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等[7-9]。

如果在早期發現，HCC 患者可以得到良好的治療，主要的治療手段是手術切除或者肝移植[10]。但是，大多數HCC 患者都在晚期才得到確診，此時已經無法進行有效的手術治療，轉而采取化療的方式破壞癌細胞并抑制癌細胞的增殖，治療效果不盡如人意[11]。綜上所述，HCC 治療的關鍵是及早發現、及時診斷和手術治療。然而目前，HCC 仍然缺少最為有效的腫瘤標志物。臨床應用的腫瘤標志物陽性率尚無法令人滿意，誤診情況屢有出現。為此，本研究結合生物信息學和臨床檢驗方法，篩選出HCC 中兩個最為重要的靶點基因，然后構建了診斷模型，并且在臨床樣本中進行一對一精確驗證。該研究豐富了HCC 的早期診斷，為該疾病的研究提供了理論基礎。

1 資料和方法

1.1 差異基因篩選 數據源HCC 患者樣本數據獲取自TCGA（the cancer genome atlas）數據庫。本項目下載了TCGA 數據庫中426例HCC 的mRNA 數據，426例樣本中包含340例癌癥樣本和86例配對癌旁樣本。TCGA 數據庫鏈接為：https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/。本實驗使用R 語言中的edgeR 包分析不同組之間差異表達的基因（differentially expressed genes, DEGs），以對數轉換后的差異表達倍數（Log2FC）的絕對值＞1 和P＜0.05 為標準進行篩選。

1.2 富集通路分析

1.2.1 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡和核心基因的識別 本項目利用STRING（https://string-db.org/，version 11.0）分析蛋白質的功能聯系及蛋白質的相互作用，保留綜合得分大于等于0.4 的相互作用對。用Cytoscape（https://cytoscape.org/,version 3.7.2）可視化PPI 網絡。Cytoscape 軟件中的MCODE 插件識別顯著的聚類模塊，以MCODE score ＞2 為閾值進行篩選。

1.2.2 功能富集分析 用R 語言的clusterProfiler 包做GO（gene ontology）（包括biological process、molecular function 和cellular component）及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，以P＜0.05 為標準篩選顯著富集的GO 和KEGG 通路。

1.3 SLC7A11 和CCDC14 濃度檢測1.3.1 研究對象 回顧性分析天津醫科大學腫瘤醫院2018年1月-2019年12月經病理確診的HCC患者。納入標準：所有病例均經病理證實；有完整的影像學檢查資料；未經放化療。排除標準：存在其他腫瘤病史；存在其他肝臟慢性疾病。

本研究經本院倫理委員會批準（KY2018C278），并與患者或家屬簽署知情同意書。根據以上標準，將試驗對象分為兩組：HCC 陽性患者為HCC 組，共195例，其中男性114例，女性81例；HCC 陰性正常人群為對照組，共107 名，其中男性60 名，女性47 名。1.3.2 ELISA檢測 SLC7A11（solute carrier family 7 member11）和CCDC（Coiled-coil domain-containing）14 濃度測定采用ELISA 雙抗體夾心法，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行（試劑盒選自Abcam 公司）,本項目的待測樣品提取自外周血。為了減少待測人群凍存后細胞數量和檢測因子受損嚴重情況，影響指標檢測，本項目樣本采用新鮮提取的外周血，分批次對待測人群進行檢驗，最終的數據進行統一整理。標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標準品100 mL，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50 μL，混勻；以此類推，逐步稀釋，最終稀釋后各孔加樣量都為50 μL，濃度分別為24 μg/L、16 μg/L、8 μg/L、4 μg/L 和2 μg/L；加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5 倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。配液：將30 倍（48T 的20 倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍（48T 的20 倍）稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，如此重復5 次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。進一步溫育和洗滌。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。測定：以空白調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 min 以內進行。

1.4 統計學處理 采用Excel 2013 軟件建立數據庫，SAS 9.4 和SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析。對連續性變量進行正態分布檢驗，符合正態分布的變量以±s 表示，采用SAS 9.4 中的Paired-t test 方法用于數據比較。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異表達基因的分析結果 為了消除批次誤差效應，本項目首先對芯片原始數據進行標準化（圖1A）。340例HCC 樣本和86例癌旁樣本進行基因差異化分析結果顯示：454個基因表現出顯著性差異，可列為DEGs，其中上調基因234個，下調基因220個（圖1B）。

圖1 HCC 和癌旁組織差異基因分析Fig 1 Analysis of differentially expressed genes in HCC cancer samples and adjacent tissues

2.2 富集分析結果 通過基因富集分析，差異表達基因主要集中在neuroactive ligand-receptor interaction 通路中（圖2A）。PPI 網絡篩選出針對HCC 發展最重要的10個基因，其中SLC7A11 和CCDC14 排名最靠前，意味著這兩個基因在HCC 形成中的重要性最高（圖2B）。

圖2 KEGG 富集分析結果和PPI 網絡篩選的重要基因Fig 2 Results of KEGG enrichment analysis and important genes screened by PPI network

2.3 SLC7A11 和CCDC14 檢測結果 與對照組相比，HCC 組SLC7A11 濃度顯著升高；CCDC14 濃度亦有明顯提高。以發現的正常最高值作為檢測標準，SLC7A11 和CCDC14 針對HCC 檢測陽性率達到標準（表1）。

表1 SLC7A11 和CCDC14 濃度檢測（±s）Tab 1 Analysis of concentration for SLC7A11 and CCDC14（±s）

表1 SLC7A11 和CCDC14 濃度檢測（±s）Tab 1 Analysis of concentration for SLC7A11 and CCDC14（±s）

注：HCC：肝細胞癌；與對照組相比，*P＜0.05

組別 SLC7A11（ng/mL） CCDC14（pg/mL）HCC 組 70.12±14.30* 6.17±2.31*對照組 23.12±7.11 2.13±0.84 t 6.17 5.35 P＜0.001 ＜0.001陽性率（%） 80.20 68.80

3 討論

HCC 治療效果主要取決于早期精確診斷、及時的手術治療以及有效的預后預測模型。然而，目前臨床上該惡性腫瘤尚缺乏令人滿意的臨床標志物。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是目前全世界應用最廣泛的HCC 腫瘤標志物，診斷HCC 的敏感度為39%～65%，特異度為76%～94%。其敏感度和特異度均不令人十分滿意，尤其在具有小腫塊的HCC 早期階段，80%的患者血清AFP 并未見明顯升高。近幾年HCC 的基礎和臨床研究也提出了若干新型腫瘤標志物[12]。例如高爾基體蛋白73（golgi protein 73，GP73）和甲胎蛋白異質體3（alpha fetoprotein-L3，AFP-L3）等。GP73 在正常人的肝細胞中表達量極低或者不表達，而在HCC 患者血清中明顯升高，然而有諸多報道證實肝炎和脂肪肝患者中也存在著GP73 水平顯著升高。AFP-L3 是AFP 異質體的一種。AFP-L3 為肝癌細胞特有，當臨界值設為10%～15% 時，約1/3 的小肝癌（＜3 cm）患者血清AFP-L3陽性；而＞15%時，AFP-L3 的敏感度為75%～96.9%，特異度為90%～92%。然而有文獻對于AFP-L3 在HCC診斷方面有效性的報道卻不一致，一項納入12 篇文章的Meta 分析指出AFP-L3 比AFP 有更高的特異度，但敏感度較低[13]。基于這些事實，有必要尋找更有效、更可靠的HCC 臨床標志物。

本研究對TCGA 中HCC 樣品和癌旁對照樣品進行了差異表達基因分析，以揭示潛在的關鍵性差異基因。實驗從340個癌癥樣本和86個相鄰對照樣本中篩選了454個差異基因，其中高表達的234個，低表達的220個。這些差異基因主要集中在神經活性配體-受體通路中。Liu 等[14]實驗證明神經活性配體-受體通路與HCC 相關，因為諸多在人肝中表達的基因參與神經活性配體-受體相互作用途徑。另外，Zhao 等[15]發現，肝癌的早期、中期和晚期都存在神經活性的配體-受體相互作用。因此，該途徑在HCC進展中似乎很重要。

本項目確定了若干個有顯著表達差異的基因，其中最為突出的兩個基因是SLC7A11 和CCDC14，這為將來的研究提供了非常有價值的起點。SLC7A11 是廣泛存在于肝細胞膜上面的特異性離子進出通道，之前有報道稱其在HCC 存在差異性表達。SLC7A11 在HCC 中的差異性表達可能與HCC 變異細胞中特定改變的分子信號有密切聯系[16]。CCDC 卷曲螺旋結構域結構基因，其表觀遺傳的改變已經證實與包括鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌在內的多種惡性腫瘤息息相關。其在HCC 中的作用尚未明了[17]。

總體而言，本項目全面揭示HCC 的差異性基因圖譜，并且提出了兩個可行的創新臨床腫瘤標志物，為HCC 臨床診斷和治療提供了新的思路。本研究為單中心研究，樣本量有限，尚存在一定的局限性。為了使SLC7A11 和CCDC14 作為HCC 特異性的標志物廣泛地應用于臨床檢驗，未來還需要進行多中心、大樣本量研究。