重組質粒pcDNA4-FLAG-GLUT1 構建及蛋白表達

徐子豪，史小雨，王倩

（天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津300070）

瘧疾是由瘧原蟲（plasmodium）感染所引起的寄生蟲疾病，通過雌性按蚊叮咬人體傳播，在全球范圍內仍有著較高的發病率和死亡率[1]。瘧原蟲在人體的寄生生活主要分為肝細胞期和紅細胞期，其中以紅細胞期引起的臨床癥狀最為明顯[2]。紅細胞期瘧原蟲的能量來源主要依靠攝取宿主血液中的葡萄糖進行糖酵解[3]。葡萄糖依次通過紅細胞膜表面葡萄糖轉運蛋白（GLUT）1、包繞瘧原蟲的納蟲泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）和瘧原蟲質膜上的己糖轉運蛋白（hexose transporter，HT），最終進入瘧原蟲體內[4]。由于無氧糖酵解產生ATP 效率低下，瘧原蟲需要攝取大量葡萄糖以維持正常生長[5]。

GLUT1 在人體內廣泛存在，是紅細胞和血-腦屏障中最主要的GLUT。有研究報道，對正常紅細胞和感染惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，P. falciparum）的紅細胞進行磷酸化蛋白質組學分析，發現感染紅細胞表面GLUT1 的磷酸化狀態發生改變[6]；在伯式瘧原蟲（Plasmodium berghei，P. berghei）感染的肝細胞階段，肝細胞會上調細胞表面GLUT1 的表達量和轉運效率以增加葡萄糖的攝取[7]；而在人類遺傳疾病GLUT1 缺陷綜合征中，GLUT1 磷酸化狀態的改變也會影響葡萄糖的正常吸收[8]。可見，GLUT1 的磷酸化水平對其在細胞表面的表達量及葡萄糖轉運效率至關重要。

GLUT1 的磷酸化既可能引發胞漿內的GLUT1囊泡轉位到細胞膜，又可能調控細胞表面GLUT1 的葡萄糖轉運效率。而紅細胞缺乏囊泡轉運機制，只能通過調節GLUT1 轉運葡萄糖的速率來調節葡萄糖的攝取[8]。為了探究感染紅細胞GLUT1 磷酸化狀態對葡萄糖吸收的影響，本實驗室前期已經對正常和感染惡性瘧原蟲的紅細胞膜蛋白進行質譜分析，找到一些與瘧原蟲感染相關的GLUT1 特異性磷酸化位點。由于紅細胞無法進行基因轉染，為了研究這些位點的磷酸化狀態在瘧原蟲感染紅細胞中的作用，本研究首先擬在其他細胞中檢測這些位點的磷酸化對細胞表面GLUT1 表達量和轉運葡萄糖效率的影響。為了盡量降低內源性GLUT1 對檢測的影響，選擇低表達GLUT1 的小鼠胚胎成纖維細胞系NIH/3T3 進行細胞表面GLUT1 表達水平的定量檢測。GLUT1為12 次跨膜蛋白，直接用抗體檢測GLUT1 的細胞外結構域靈敏度較低[9]，且其N 端和C 端均朝向細胞質內。因此，為了更為準確地檢測細胞表面GLUT1的表達水平，本研究首先通過分子克隆的方法，在人GLUT1 第一個胞外區中插入2×FLAG 序列，以pcDNATM4/TO/myc-His B 為載體，構建pcDNA4-2×FLAG-GLUT1，并將其導入NIH/3T3 細胞中，利用抗FLAG 抗體，即可定量檢測細胞表面GLUT1 的表達水平，為后續探究瘧原蟲感染紅細胞GLUT1 磷酸化位點的功能提供了必要的分子工具。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞系、質粒和菌株小鼠胚胎成纖維細胞系NIH/3T3 于本實驗室保存，哺乳動物細胞表達載體pcDNATM4/TO/myc-His B 由南開大學生命科學院胡俊杰課題組提供，感受態細胞Mach1-T1 購自北京博邁德基因技術有限公司。

1.2 主要試劑 限制性核酸內切酶BamHⅠ和HindⅢ購自美國NEB 公司，In-Fusion?HD Cloning試劑盒購自寶日醫生物技術（北京）有限公司，質粒小提試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購自全式金生物技術有限公司，質粒中提試劑盒購自Qiagen 公司；DMEM 培養基、LipofectaminTM2000 試劑盒購自美國Invitrogen 公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；用于流式的anti-DYKDDDDK，山羊抗兔IgG（PE-conjugated）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，用于Western 印跡的anti-FLAG 抗體購自美國Sigma 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 目的基因片段GLUT1-Ⅰ、GLUT1-Ⅱ和GLUT1-Ⅲ的獲取 以人類GLUT1 基因編碼區（1～1479 bp）為模板，在GLUT1 的第一個胞外區序列中，即在第55 位氨基酸和第56 位氨基酸之間插入2個連續的FLAG 標簽。首先進行分段PCR，分別擴增片段GLUT1-Ⅰ（GⅠ，1～165 bp）和GLUT1-Ⅰ′（GⅠ′，166～1479 bp），并在GⅠ的上、下游分別引入HindⅢ酶切位點和2×FLAG 序列，GⅠ′的上、下游分別引入部分1×FLAG 序列和BamH Ⅰ酶切位點。以GⅠ′為模板進一步擴增出片段GLUT1-Ⅱ（GⅡ，166～541 bp）和GLUT1-Ⅲ（GⅢ，517～1479 bp）（PCR引物見表1）。PCR 反應條件：預變性98 ℃5 min，以98 ℃30 s，55 ℃20 s，68 ℃1 min，循環35 次，68 ℃終延伸5 min，4℃終止反應。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，切膠回收。

1.3.2 重組質粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 的構建 通過overlap PCR 將GⅠ和GⅡ連接得到片段GⅠ+Ⅱ（607 bp，引物為F231 和R382），利用In-Fusion 無縫克隆的方法將片段GⅠ+Ⅱ、GⅢ與經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后的pcDNATM4/TO/myc-His B 質粒連接（反應條件為50℃，30 min）。將連接產物轉化至感受態細胞Mach1-T1 中，在含氨芐的LB 固體培養基上密集涂布后于37℃恒溫培養箱倒置培養12～14 h，次日挑取單克隆于LB 液體培養基中搖菌擴增后提取質粒。酶切鑒定及DNA 測序確認2×FLAG 序列成功插入GLUT1 第一個胞外區，得到重組質粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。大量制備重組質粒用于細胞轉染。

表1 構建重組質粒引物序列Tab 1 Construction of primer sequences of vector

1.3.3 細胞的培養與轉染 小鼠胚胎成纖維細胞系NIH/3T3 在含10%FBS 的DMEM 培養基中培養，置于37℃、5%CO2的培養箱。當細胞融合度達到70%～90%時，根據LipofectaminTM2000 試劑說明書，以OpitMEMTM培養液分別稀釋質粒與轉染試劑，將兩者混勻后轉染細胞，4～6 h 后更換培養基。實驗組轉染pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 質粒，對照組轉染pcDNA4 空載質粒。

1.3.4 蛋白質印跡法檢測細胞內FLAG-GLUT1 的表達 轉染后24 h 收集細胞，提取總蛋白，加入還原性上樣緩沖液后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；凝膠分離后通過濕轉法將蛋白轉移到PVDF 膜上（100 V，2 h）；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；FLAG 抗體（1：1000 稀釋）和內參β-actin 抗體（1：4000 稀釋）4℃孵育過夜；次日以1×PBST 洗膜3 遍；辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠第二抗體（1：4000 稀釋）室溫孵育1 h；1×PBST 漂洗3 遍；采用化學發光法顯色并曝光。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞表面FLAG-GLUT1 表達 細胞轉染后24 h 使用細胞刮刀將細胞解離，制成單細胞懸液；加入CD16/32 抗體（1∶200 稀釋）4℃封閉15 min；再加入anti-DYKDDDDK 抗體（1∶1000稀釋）4℃孵育1 h；1×PBS 洗滌后加入PE 耦聯的山羊抗兔IgG（1∶250 稀釋）4℃孵育30 min；PBS 洗滌后過濾上機檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 25.0 統計軟件進行數據分析，正態分布的計量資料以±s 表示，組間比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 重組質粒的構建 為了檢測細胞表面GLUT1 表達量，在GLUT1 第一個胞外區Ser55 和Ile56 之間插入2×FLAG 序列，從而可以利用anti-DYKDDDDK 抗體經流式細胞術檢測細胞表面的GLUT1 表達量。本實驗選用pcDNATM4/TO/myc-His B 質粒，含有真核基因CMV 強啟動子，轉染細胞后可大量表達目標蛋白。

圖1 pcDNATM4/TO/myc-His B（左）與pcDNA4-2×FLAG-GLUT1質粒圖譜（右）Fig 1 Plasmid profiles of pcDNATM4/TO/myc-His B(left)and pcDNA4-2×FLAG-GLUT1（right）

由于需要在GLUT1 蛋白內部插入2×FLAG 序列，首先擴增出GⅠ和GⅠ′片段（圖2A），在GⅠ末端引入2×FLAG 序列。鑒于GⅠ和GⅠ′片段大小差距較大，不易直接通過overlap PCR 進行連接。因此，進一步以GⅠ′為模板分別擴增GⅡ和GⅢ兩個小片段（圖2B）。經overlap PCR 連接片段GⅠ和G Ⅱ，利用In-Fusion 無縫克隆技術將片段G Ⅰ+Ⅱ和GⅢ同時插入線性化的質粒pcDNA4，即得到重組質粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。重組質粒經Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切鑒定插入片段大小正確（圖2C），DNA 測序無誤。

圖2 重組質粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 的構建及鑒定Fig 2 Construction and identification of plasmid pcDNA4-2 ×FLAG-GLUT1

2.2 轉染后NIH/3T3 細胞FLAG-GLUT1 的表達 NIH/3T3 細胞經pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 轉染后，檢測細胞內轉入的GLUT1 的表達水平。用anti-FLAG 抗體檢測細胞中FLAG-GLUT1 的總表達量，以β-actin 作為內參。與轉染空載質粒相比，在40～50 kD間有一條特異性條帶（圖3 箭頭處），大小與GLUT1 蛋白分子量符合，提示pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 被導入NIH/3T3 細胞后FLAG-GLUT1 表達正常。

圖3 Western 印跡檢測NIH/3T3 細胞轉染后FLAG-GLUT1 蛋白的表達量Fig 3 Detection of the amount of FLAG-GLUT1 in NIH/3T3 cells by Western blotting

2.3 NIH/3T3 細胞表面GLUT1 的定量檢測 NIH/3T3 細胞經pcDNA4-FLAG-GLUT1 轉染后，用anti-DYKDDDDK 抗體識別細胞表面FLAG 標記的GLUT1 的表達情況。流式檢測結果顯示，轉染重組質粒的細胞表面可檢測到FLAG-GLUT1 的表達，陽性群比例為（21.46±2.375）%，明顯高于對照組（0.01±0.00）%，差異有統計學意義（t=9.035，P＜0.01）（圖4），提示可以通過FLAG 抗體檢測細胞表面FLAGGLUT1 的表達量的變化。

圖4 流式細胞術檢測細胞表面FLAG-GLUT1 的表達Fig 4 Detection of FLAG-GLUT1 expression on cell surface by flow cytometry

3 討論

瘧原蟲在人體細胞內寄生需要攝取大量的葡萄糖供能，以維持其生長發育。在瘧原蟲感染的紅細胞期，葡萄糖主要以無氧糖酵解的方式提供能量。目前已建立了惡性瘧原蟲葡萄糖代謝相關的酶動力學模型，為潛在的藥物治療靶標研究提供了工具[10]。有研究報道，瘧原蟲質膜上的己糖轉運蛋白也可能成為潛在的藥物治療靶標，通過限制葡萄糖的攝取抑制瘧原蟲的生長發育[4，11-12]。

葡萄糖是各種生物最基本的能量來源，主要通過細胞膜上的GLUTs 被細胞吸收，其中以GLUT1、2、3、4 的生理功能最為重要，GLUT1 因發現最早而得名。GLUTs 屬于主要協同轉運蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS），具有典型的折疊模式，由12個跨膜螺旋組成N 端和C 端兩個結構域，各包含了一對重復的反向結構[13]。GLUT1 的失活突變會影響葡萄糖轉運活性，導致癲癇、大腦萎縮和發育遲緩等一系列癥狀，稱為GLUT1 缺陷綜合征。通過比較捕獲到的GLUT1 和木糖轉運蛋白XyIE 的晶體結構發現，GLUT1 轉運機制可能是通過胞內區4個α 螺旋組成的結構域（intracellular helical bundle，ICH）與C 端的相互作用介導的[14]。在GLUT1 缺陷綜合征已經發現的突變位點中，可能主要通過影響ICH 與C 端的相互作用從而影響葡萄糖轉運。當細胞內ATP 充足時，ATP 與GLUT1 結合，引起GLUT1 的loop6-7 和C 端的相互作用，進而抑制其對葡萄糖的吸收[15]。有研究表明，GLUT1 的Ser226位點的磷酸化可通過上調細胞表面GLUT1 的表達量和GLUT1 的活性，增加葡萄糖的吸收[8]。在肌肉組織中，GLUT1 的Ser490 位點的磷酸化也通過相似的機制增加葡萄糖的吸收[16]。上述位點的磷酸化可能改變了GLUT1 內部的空間結構，影響N 端和C端的相互作用，從而影響葡萄糖的吸收速率。因此，通過對正常和感染惡性瘧原蟲的紅細胞膜蛋白進行質譜分析，篩選出可能的與瘧原蟲感染的特異性磷酸化位點，從而進一步分析其功能。

本研究構建的pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 重組質粒，在GLUT1 第一個胞外區中間插入2×FLAG 序列，轉染細胞后，可通過FLAG 抗體檢測細胞表面GLUT1 表達水平的變化。與常規的直接用GLUT1抗體檢測細胞表面GLUT1 的表達相比，具有更高的靈敏度。由于無法對紅細胞進行基因轉染，在后續的研究中，擬在低表達GLUT1 的NIH/3T3 細胞中對質譜篩選出的候選位點進行模擬磷酸化和去磷酸化點突變，通過檢測細胞表面FLAG-GLUT1 表達水平的變化，首先明確特定位點磷酸化狀態是否與GLUT1 囊泡轉位相關；繼而在體外將純化蛋白FLAG-GLUT1，并重組至脂質體中，借助3H 標記的2-脫氧-D-葡萄糖檢測其轉運葡萄糖的速率，鑒定這些磷酸化位點對GLUT1 活性和表達量的影響，從而推測GLUT1 的磷酸化在瘧原蟲感染的紅細胞發揮的潛在功能。

綜上所述，GLUT1 對于瘧原蟲在紅細胞期的生長發育十分重要，本研究不僅為檢測GLUT1 在細胞膜上的表達水平提供了有力的工具，更有助于后續進一步研究GLUT1 磷酸化在瘧原蟲感染過程中的作用。