棘胸蛙歪頭病的病原分離鑒定與防治試驗

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)俗稱石蛙、石雞等，屬蛙科、棘蛙屬，其棲息地主要分布在我國南方各省的密林溪澗中。棘胸蛙肉質細嫩、味道鮮美，同時具有很高的藥用價值，深受消費者的喜愛。隨著自然資源量的下降，被世界自然保護聯盟(IUCN)列為易危(VU)保護等級，是浙江省的重點陸生野生保護動物。人工養殖是促進棘胸蛙資源恢復和保護的重要舉措，2020 年國家出臺政策將棘胸蛙劃歸漁業部門按水生動物管理，其人工養殖也將會進入快速發展期。

在棘胸蛙養殖過程中，病害問題是制約其發展的瓶頸。尤其是一種以病蛙頭部歪斜、白內障或藍眼、在水中打轉等癥狀的歪頭病，因發病率、死亡率高，給養殖業造成了較大的經濟損失。棘胸蛙歪頭病的病原鑒定多為腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)，但是，我們在2020 年對發病棘胸蛙歪頭病的病原分離中發現主要病原為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，結合攻毒試驗表明，弗氏檸檬酸桿菌也能復制出歪頭癥狀。我們對該病原進行了藥物敏感性試驗和室外治療試驗，以期為棘胸蛙養殖中該病的診斷與防治提供參考。

一、棘胸蛙歪頭病癥狀

棘胸蛙歪頭病在整個養殖季節都有發生，主要在6－8月。2020年8月2日我們從浙江遂昌獲得病蛙，主要表現為頭部歪斜、眼睛發白或出現藍眼，解剖發現肝臟發黑、脾臟腫大、腸壁變薄透明、腸道空、腸內有少量淡黃色黏液(圖1)。

圖1 病蛙頭部及解剖癥狀

二、病原分離鑒定

1.分離 將患病棘胸蛙進行剖檢，無菌操作取肝、脾、腎、腦組織劃線接種在大豆酪蛋白瓊脂培養基(TSA)上，挑取單菌落28℃下進行純化培養18～24小時，觀察菌落及細菌形態特征。

2.攻毒 將獲得的優勢純化菌株接種于TSA平板，28℃恒溫培養24 小時，用0.8%的無菌生理鹽水洗下，麥氏比濁法將細菌濃度調整為每毫升1.0×107CFU。健康棘胸蛙室內暫養5 天后，每只腹腔注射0.2 毫升，共10 只，對照組注射等量生理鹽水。接種后每天觀察棘胸蛙的臨床癥狀和死亡情況，連續觀察14天。

3.生理生化鑒定 生理生化鑒定采用梅里埃VITEK2 compact微生物全自動鑒定系統。

4.分子鑒定 采用TaKaRa 公司的16S rDNAPCR 擴增試劑盒提取菌株的DNA，采用擴增細菌的PCR通用引物，正向引物F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，反向引物R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR 擴增反應條件：25 微升反應體系，每管依次加入10 微升Taq 酶、上下游引物各1 微升，模板1 微升，加超純水10 微升。反應程序：94℃變性1 分鐘，54℃退火1 分鐘，72℃延伸1 分鐘，30 個循環；72℃終延伸7 分鐘。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。PCR 擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果與GenBank中已知核酸序列進行BLAST比對分析。

三、防控試驗

防控試驗選擇敏感藥物恩諾沙星，結合解毒促代謝和增強免疫的中藥制劑應激寧、銀黃可溶性粉、黃芪多糖進行內服治療5～7 天。外用消毒藥物選擇以刺激性小的大黃流浸膏和復合碘混合液0.3毫克/升，每天1次，連用3次。

四、結果

1.病原鑒定 經對分離的優勢菌進行攻毒試驗，健康棘胸蛙7天內都發病死亡，其中有部分出現歪頭、白內障等癥狀，但50%的發病死亡蛙未見明顯癥狀。對致病菌進行形態特征觀察，該菌落呈乳白色、不透明或半透明、凸起、邊緣光滑整齊，恒溫培養24 小時后菌落直徑為1.0～3.0 毫米。經生理生化與分子鑒定，確定為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)。

2.藥敏試驗 致病菌的藥物敏感試驗結果表明，該菌株對恩諾沙星、氟苯尼考、強力霉素高敏，對紅霉素、新霉素中敏，對SMZ、青霉素、慶大霉素、頭孢Ⅳ、利福平等耐藥。

3.防控效果 8 月4 日開始，將10%恩諾沙星4克＋應激寧8克＋銀黃可溶性粉2 克＋黃芪多糖0.5 克拌加1 千克黃粉蟲，連續內服5 天，其中恩諾沙星為3 天；外用大黃流浸膏和復合碘混合液0.3 毫克/升，每天1 次，連續3 天；對投料區也進行潑灑消毒。8 月4 日當天死亡258 只，8 月 5 日 死 亡 220 只 ， 8 月 6 日 死 亡115 只，8 月 7 日死亡 84 只 ，8 月 8 日死亡12只，8月10日以后未見死亡病蛙，顯示較好的治療效果。

五、小結

棘胸蛙歪頭病是棘胸蛙、黑斑蛙、牛蛙養殖中的常見病害，病原鑒定比較統一的是腦膜炎敗血伊麗莎白菌，但不排除歪頭為一種癥狀、多種病原引起。從實驗室對不同來源的歪頭病例檢測發現，6－7 月送檢的黑斑蛙歪頭病還帶有較為明顯的腎臟囊腫，而8月送檢的歪頭病蛙則囊腫不明顯，也顯示出不一樣的病理特征。

弗氏檸檬酸桿菌過去常常被認為是腸道致病菌，近年來發現，毒力較強的菌株可能穿過腸道黏膜，進而在全身擴散傳播，引起機體系統感染，而不僅僅局限于腸道感染。患病棘胸蛙腸壁變薄、腸道黏膜免疫系統受損，可能促使了該病的發生。近年來，肝腸損傷導致的疾病非常普遍，在魚類、兩棲類報道較多，因此，我們考慮肝腸代謝問題可能是該病發生的一個關鍵誘因。由于棘胸蛙投喂的黃粉蟲脂肪含量高，在水溫適宜、投喂量加大以后，造成腸道和肝臟負荷增大，產生的大量自由基氧化造成腸黏膜和肝損傷，導致腸道變薄和肝臟顏色發黑等癥狀，機體的抗應激和免疫機能下降，從而促進各種病原微生物的感染。在治療過程中添加應激寧和免疫多糖，可以緩解自由基損傷、增強機體免疫功能，并對腸壁修復有一定的效果。實踐表明，控制投料、保持料臺清潔、定期用中草藥消毒劑消毒，該病害的發生就少，即使發病治療的效果也較好。