NGR 修飾唑來膦酸長循環脂質體制備及其表征研究

葉雪丹 顧露囡 王 增

第三代雙膦酸鹽類藥物唑來膦酸（zoledronic acid，ZOL）臨床上主要用于治療腫瘤相關高鈣血癥及惡性腫瘤骨轉移引起的骨痛。ZOL 血漿半衰期僅為15min，體內的藥代動力學特征影響ZOL 在腫瘤組織的分布，無法作用到腫瘤細胞，不利于臨床抗腫瘤治療[1]。近年研究發現，ZOL 能通過調節腫瘤微環境中的腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macro-phages，TAMs）數量和活性，抑制腫瘤新生血管的生成，腫瘤細胞的侵襲、浸潤等作用，從而發揮抗腫瘤作用[2]。本課題組擬利用APN/CD13 在腫瘤新生血管內皮細胞表面高表達的特性，合成APN/CD13 的配體天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸（Asn-Gly-Arg，NGR），將NGR 修飾在脂質體表面，構建具有腫瘤血管靶向功能的NGR 修飾ZOL 長循環脂質體（NGR-PEG-ZOL-LPs），并對其進行表征，為進一步研究體內外抗腫瘤作用奠定基礎[3]。

1 材料與方法

1.1 儀 器 高效液相色譜儀（日本島津公司，型號LC-20AD），激光粒徑分析儀（英國Malvern 公司，型號Nano-ZS），透射電子顯微鏡（日本Jeol 公司，型號JEM-1200EX），冷凍干燥機（美國LABCONCO 公司，型號Labconco FreeZone）。

1.2 試 劑 大豆卵磷脂（德國Ludwigshafen 公司，批號04010025119），膽固醇（美國Avanti Polar Lipids公司，批號Lot X0515），mPEG2000-DSPE（上海芃碩生物科技有限公司，批號Lot L003），Asn-Gly-Arg，NGR 多肽和NGR-mPEG2000-DSPE 由江蘇強耀生物科技有限公司合成（批號Lot L003），ZOL 原料藥（江蘇正大天晴醫藥股份有限公司，純度>99%，批號20180605），ZOL 標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號100778-201003），其他試劑均為分析純。

1.3 NGR-PEG-ZOL-LPs 制備 在圓底燒瓶中加入磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000、NGR-DSPE-PEG 2000（質量比為20:7:5:6:0.4），加入6mL 氯仿/甲醇（4：2v/v）。使用旋轉蒸發器在40℃減壓下除去溶劑，形成一層薄的脂膜。用預熱的6mg/mL ZOL pH7.6 緩沖鹽溶液水合，手動震搖。脂質體懸浮液在60℃下放置水浴磁力攪拌30min，每15min 取出震搖，快速3次冷凍解凍（-80℃～37℃）。使用14000Da MWCO 透析袋針透析24h 去除游離ZOL。分級過濾后加入58mM 乳糖作為凍干支持劑，再過0.22μm 濾膜，放入-20℃冰箱內預凍48h，抽真空干燥。

1.4 表征研究 取NGR-PEG-ZOL-LPs 樣品（稀釋20 倍）置于樣品池中，用Malvern ZS90 粒徑電位儀測定脂質體的粒徑分布和電位，重復三次。取NGRPEG-ZOL-LPs 樣品（稀釋20 倍），用透射電鏡觀察其表面形態，采用懸滴法制備樣品，將納米粒水溶液滴加到銅網的支撐膜上，用濾紙小心吸干表面水分后，醋酸雙氧鈾染色，并用濾紙吸取多余的水，晾干，透射電鏡觀察其結構。

1.5 包封率和載藥量檢測

1.5.1 ZOL 色譜條件建立 色譜柱：ZORBAX SBC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈：水相（焦磷酸鈉緩沖液，稱取焦磷酸鈉1.7804g，溶于500mL水，加3mL 10%四丁基氫氧化銨，用50%磷酸調節pH 至4.00）=4：96。流速：0.8mL/min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：215nm；進樣量：20μL。

1.5.2 標準溶液配制 精密稱取1.07mg ZOL，用pH7.6 緩沖液制備成1070μg/mL 的儲備液。流動相稀釋儲備液并制備含ZOL 為66.88、33.44、16.72、8.36、4.18、2.09μg/mL 的標準溶液，進樣20μL，記錄峰面積，并繪制標準曲線。

1.5.3 包封率和載藥量測定 制備得到的ZOL 脂質體裝入透析袋內，透析24h，每隔4h 更換1 次pH7.6緩沖液。取100μL 透析后的樣品，加入300μL 甲醇超聲破壞，再加入600μL 流動相，9000rpm，離心5min，取上清液進HPLC。計算公式：EE%（W0-W1）/W0×100%。DL%＝（W0-W1）/Wt×100%（EE%：包封率；DL%：載藥量；W0：ZOL 投藥量；W1：未包裹進脂質體中的藥物量；Wt：脂質材料與脂質體中ZOL 的質量之和）。

2 結果

2.1 ZOL 色譜條件 NGR-PEG-ZOL-LPs 溶液中ZOL 的主峰與ZOL 標準品溶液主峰的保留時間一致，說明脂質體輔料對ZOL 的檢測無影響，方法專屬性良好。同時，根據色譜方法學研究得到的回歸方程為Y=18631X-1494.6，r2=1，表 明ZOL 在2.09～66.88μg/mL 內，具有良好的線性關系（見插頁圖1）。

圖1 ZOL 色譜圖

圖2 NGR-PEG-ZOL-LPs 透射電鏡圖（醋酸雙氧鈾染色×50000）

2.2 表征研究結果 透射電鏡下顯示NGR-PEGZOL-LPs 呈類圓形，大小分布均勻，無明顯聚集（見插 頁 圖2）。NGR-PEG-ZOL-LPs 的 平 均 粒 徑 為（271.43±9.23）nm，Zeta 電位為-（36.20±0.20）mv，多分散系數（PDI）為（0.15±0.03），理化性質相對穩定。

2.3 包封率和載藥量測定 根據公式計算，NGRPEG-ZOL-LPs 包封率為8.41%，載藥量為2.12%。

3 討論

靶向遞藥系統已成為腫瘤治療的有效策略。氨肽酶N（APN/CD13）是在腫瘤新生血管內皮細胞表面高度表達的跨膜蛋白，NGR 是由Asn-Gly-Arg 組成的三肽小分子，對在腫瘤新生血管內皮細胞表面高表達的APN/CD13 具有高度親和力，可以作為腫瘤血管靶向修飾物[4]。本研究將NGR 的氨基端與mPEG 2000-DSPE 的羧基端通過氨酰脫水縮合反應形成NGR-mPEG2000-DSPE，親水端的NGR 多肽暴露在脂質體外層，有利于其尋找腫瘤血管特異性靶點[5]。實驗結果顯示，NGR-PEG-ZOL-LPs 的Zeta 電位為-（36.20±0.20）mv，相關研究表明，當Zeta 電位的絕對值>20 時，脂質體相對穩定，同時本研究組將脂質體凍干粉重新用PBS 分散后測到的多分散系數（PDI）為（0.15±0.03），說明脂質體分散性較好，不易出現聚集，有利于凍干粉臨床使用[6]。

同時，研究結果發現，NGR-PEG-ZOL-LPs 包封率為8.41%，可能主要有以下原因造成：（1）脂質體的包封率與粒徑大小密切相關，粒徑越大，包封率也會越大；（2）與藥物的性質有關，ZOL 水溶性較高，容易從脂質體表面存在小孔泄漏出來，導致包封率的下降。因此，我們將在下一步研究中提高ZOL 的包封率。

本研究以腫瘤微環境中數量最多的炎癥細胞群TAMs 作為靶點，是腫瘤治療的潛在靶點。TAMs 大量存在于腫瘤血管周圍、無血管區和低氧區，其中M2型TAMs（M2-TAMs）則在腫瘤的侵襲、轉移、免疫抑制、新生血管形成等方面發揮了不可忽視的重要作用，不僅是侵入實體腫瘤中單核細胞群的主要組成細胞，也是炎癥進展成癌癥的主要橋梁[7-8]。臨床樣本檢測表明，M2-TAMs 在乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內膜癌、肺癌等上皮來源的腫瘤組織中大量存在，是引起這些腫瘤耐藥、轉移、侵襲的重要因素[9]。由此可見，抑制M2-TAMs 的功能，減少其數量，是提高抗腫瘤效果的有效手段。

本實驗制備的NGR-PEG-ZOL-LPs 理化性質穩定，本課題組將通過體內實驗進一步探討NGRPEG-ZOL-LPs 對M2-TAMs 抑制作用。