施氮對森林生態系統AM真菌群落組成及多樣性的影響

趙愛花,劉 蕾,付 偉,武 慧,陳保冬

1 中國科學院生態環境研究中心城市與區域生態國家重點實驗室, 北京 100085 2 中國科學院大學, 北京 100049 3 南京信息工程大學生態研究院,江蘇省農業氣象重點實驗室, 南京 210044

自工業革命以來,大量化石燃料的燃燒,以及農業和工業生產活動中氮(N)素消耗大量增加,加速了全球大氣N沉降并導致一系列生態環境問題。據估計,1995年全球平均N沉降速率大約是1860年的3倍,而2050全球平均N沉降速率將增加到1860年的6倍[1]。我國陸地生態系統N沉降速率已達21.1 kg hm-2a-1[2],其中,濕沉降速率已經由20紀90 年代的11.11 kg hm-2a-1增加到13.87 kg hm-2a-1[3],增長了近25%,在今后幾十年中我國N沉降的形勢將更加嚴峻[2]。N沉降增加一方面可以提高受N限制的生態系統的生產力[4],另一方面過多的N素供應也會給生態系統帶來諸多負面影響,如土壤酸化[5]、植物物種多樣性喪失[6]、水體富營養化[7]等。同時,N沉降還可以通過改變土壤環境(如N的有效性、土壤酸化等)直接影響土壤微生物多樣性[8- 9],或通過地上植被的生理生態響應間接作用于土壤微生物[10]。

叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza,AM)真菌是一類在陸地生態系統中廣泛存在的土壤真菌,能與絕大多數陸地植物形成互惠共生體系,具有許多重要的生態功能,如幫助植物獲取N、P等礦質養分和水分,增強植物對生物和非生物脅迫的適應能力[11],改變植物群落的組成、多樣性,還能影響生態系統的生產力和結構功能穩定性[12- 13]。在陸地生態系統N素循環過程中,AM真菌除了能夠吸收、轉運N素以外,在N素生物固定、硝化、反硝化以及N素淋洗過程中均具有潛在重要作用[14- 15]。AM真菌一方面通過改善植物磷(P)營養,提高豆科植物的固N能力[14],另一方面可能通過影響固N微生物功能基因的表達來調控N素的生物固定[16]。AM真菌還可能通過與氨氧化微生物競爭底物[17],改變氨氧化微生物的群落組成[18]及植物根系營養生理[19]調控硝化過程,通過調控反硝化細菌的數量[20]及相關功能基因的表達進而影響反硝化過程[16]。此外,AM真菌還能夠通過改善土壤結構[21],促進宿主植物對無機N的吸收等多種途徑減少因淋洗而造成的土壤N素損失。

鑒于N沉降形勢的嚴峻性和AM真菌重要的生態功能,越來越多的土壤生態學家開始關注N沉降對AM真菌的影響并開展了試驗研究。目前,已有相關研究多采用N素添加的方式模擬N沉降,受到具體試驗條件的影響,研究結果不甚一致：N沉降對AM真菌多樣性可能有積極作用[22],沒有顯著影響[23],或者具有消極作用[24]；類似地,對于AM真菌群落組成而言,有的研究顯示N沉降有顯著影響[25- 28],而另外一些研究則顯示無顯著影響[29- 30]。影響N沉降生態效應的因素有很多,如施N速率[22]、N素形態[31]、試驗方法[29]、試驗周期[32]等。此外,還可能受到環境中N的背景值及生態系統類型的影響[33]。因此,客觀認識和評價N沉降對AM真菌的影響,還需要開展更為系統的研究工作。

總體上,目前N沉降對AM真菌多樣性和群落組成影響的研究多集中在草地生態系統,對森林生態系統的研究相對匱乏。在森林生態系統中開展的有限研究中,施N方式又多為林下施N[24- 25,29],這種方式忽略了冠層發生的一系列生態過程,如N的吸收、固定、揮發、轉化等[34-38],而這些過程都會影響到達地面的N的形態和數量[39],因此林下施N可能無法準確反映自然條件下N沉降對AM真菌多樣性和群落組成的影響。Huang等[40]研究發現,林冠施N對土壤微生物生物量和群落組成的影響小于林下施N,那么對AM真菌來說是否也是類似的情況,目前尚無相關報道。基于此,我們依托雞公山林冠模擬氮沉降野外試驗平臺,通過連續4 a的樣品采集和分析,嘗試回答這個問題。我們提出的研究假設是：林下施N模擬N沉降會高估自然N沉降對森林土壤AM真菌多樣性和群落組成的影響。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

雞公山林冠模擬N沉降野外試驗平臺于2013年建于河南省信陽市以南 38 km的雞公山國家級自然保護區(31°46′—31°52′N, 114°01′—114°06′E)的原生林中。研究區由于地處北亞熱帶邊緣秦嶺山系西端的淺山區,受東亞季風氣候的影響,具有典型的北亞熱帶向暖溫帶過渡的季風氣候和山地氣候特征,四季分明。研究區內土壤以黃棕壤、黃褐土為主,pH 值在 5.0到6.0 之間。植被類型為落葉闊葉混交林,林齡約45 a。優勢喬木樹種為麻櫟(QuercusacutissimaCarruth.)、栓皮櫟(QuercusvariabilisBl.)和楓香(LiquidambarformosanaHance),林下樹種和草本豐富。

1.2 實驗設計

實驗采用完全隨機區組設計,包括4個區組(相當于4個試驗重復),每個區組隨機設置5個半徑為17 m的樣方,對應5個試驗處理：對照(CK)、林冠施N 25 kg hm-2a-1(CN25)或50 kg hm-2a-1(CN50)、林下施N 25 kg hm-2a-1(UN25)或50 kg hm-2a-1(UN50)。為防止處理間的干擾,各樣方之間留有至少20 m的緩沖帶,每個緩沖帶中間都加裝深度為 1 m 的PVC隔離板。

N添加在每年4到10月份進行,每月一次,一年7次。添加的N素形態為NH4NO3溶液。每次施N時,添加的NH4NO3溶液相當于3 mm的降水量,一年的添加量相當于21 mm的降水量,小于該地區年均降雨量的2%,因此水分的影響可以忽略不計[41]。林冠施N和林下施N都是由位于相應樣方中心的自動噴灑裝置來實現的。林冠噴灑裝置高35 m(冠層以上約5 m),林下噴灑裝置距離地面的高度為1.5 m。該裝置頂端安裝有一套搖臂噴頭,有供水管道與樣地外的蓄水池連接,利用變頻調速恒壓噴灌設備提供壓力,驅動搖臂噴頭360° 旋轉,以保證噴灑的均勻性和精確性。塔基處供水管道安裝有水量計,可精準控制每次處理的用水量。關于裝置的細節、工作方式和效率參考Zhang等[41]。

1.3 樣品采集與分析

從2013年到2016年,每年最后一次N添加處理完成之后,進行土壤樣品采集。采樣時間為11月中下旬到12月初,具體時間視當地天氣情況而定。土壤樣品的采集和分析,以及生物信息學分析均參考Zhao等[32]。為了盡可能減少采樣位置的影響,在各樣方核心區20 m×20 m范圍內選取5棵樹作為目標樹。在距每棵目標樹1—2 m范圍內,取2鉆土(直徑3 cm,深度10 cm),每個樣方共10鉆土,制備成一個混合土樣,用冰袋運送到實驗室。混合土樣過2 mm篩之后分成兩部分,一部分冷凍干燥后儲存于-80℃冰箱,用于土壤微生物總DNA的提取；另一部分自然風干,用于測定土壤pH、有效磷(available phosphorus,AP)等基本理化性質。

土壤有效磷用0.5 mol/L的NaHCO3提取,鉬藍比色法測定[42]；土壤pH值采用水土比2.5∶1,PB- 10 pH計(Sartorius, G?ttingen, Germany)測定；銨態N、硝態N首先用2 mol/L 的KCl浸提(水土比為5∶1),然后用連續流動分析儀進行測定(SAN++, Skakar, Breda, Holland)；銨態氮、硝態氮含量之和作為有效N含量(available nitrogen, AN)；有效N與有效P之比即為N/P比。

采用Power-Soil RDNA提取試劑盒 (MO BIO Laboratories, San Diego, CA, United States),按照說明書提取土壤DNA。DNA樣品用滅菌超純水稀釋5倍,然后進行巢式PCR擴增。擴增的引物分別為AML1/AML2[43]和AMV4.5NF/AMDGR[44],擴增體系及程序設置與Zhao等[32]相同：第一次PCR反應總體積為25 μL,其中含有2.5 μL 10 × Ex-Taq緩沖液(Mg2+Plus)、2.0 μL dNTP混合物、0.25 μL Ex-Taq(5u/mL)(Takara,大連,中國)、1.0 μL(10 mg/mL)BSA(TaKaRa,大連,中國),雙端引物各0.5 μL(10 μmol/L),17.25 μL 無菌水和1.0 μL DNA模板。PCR擴增條件如下：94℃預變性3 min；94℃ 45 s,51℃ 40 s,72℃ 1 min,擴增35個循環；然后72℃延伸10 min,16℃冷卻2分鐘。第一輪的PCR產物進行10倍稀釋,作為第二輪的模板。第二輪擴增體系與第一輪相同,擴增條件如下：94℃預變性3 min；94℃ 40 s,58℃ 1 min,72℃ 1 min,擴增35個循環；然后72℃延伸10 min,4℃冷卻2 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送上海瀚宇科技有限公司切膠回收、純化、建庫及測序(Illumina Miseq PE300測序平臺)。

最初的數據質量控制和序列拼接由上海瀚宇生物科技有限公司完成。原始測序數據用 Trimmomatic v 0.32[45]進行質控,主要步驟如下：(1)刪除帶有N堿基的reads；(2)刪除低質量的reads Q value<20)；(3)刪除過短的reads(<50 bp)及其配對reads。用Mothur v.1.32.1[46]進行序列拼接,允許引物有1個堿基的錯配。刪除拼接同聚物長度>8,序列總長<200 bp的序列。嵌合體的過濾由Chimera.uchime v.4.2[47]完成。使用Usearch v.9.0.2132_i86linux32[48]在97%的相似性水平劃分OTU (operational taxonomic unit,操作分類單元)。刪除序列數<5條的OTUs。其余OTUs的代表序列和NCBI GenBank數據庫及MaarjAM數據庫進行比對,滿足下列條件的OTUs用于后續分析：Identifications >97% similarity,>90% coverage 及>200 BLAST score value,不滿足條件者被舍去。為了進一步確認分類信息的可靠性,我們把OTUs的代表序列和在GenBank數據庫中比對到的序列放在一起,采用MEGA v5[49],依據Kimura 2-parameter模型構建了Neighbor-Joining 系統發育樹。除了bootstrap數目設為1000以外,其余參數均采用默認值。

1.4 統計分析

所有的統計分析均采用R 3.3.2 (R Core Team, 2016) 完成。采用中位數稀釋法對每年的樣品測序數據進行標準化[50]。標準化后的OTU表格進行Hellinger轉化,作為分析 AM真菌群落組成的數據,也用來計算AM真菌群落的alpha多樣性指數(豐富度S、香儂指數 H、Pielou′s 均勻度指數J和辛普森指數)。用“vegan”包[51]“specnumber”函數計算豐富度。香儂指數和辛普森指數的計算采用“vegan”包“diversity”函數完成。Pielou′s 均勻度指數J=H/log(S)。采用“aov”函數進行雙因素方差分析,評估施N方式和施N速率對土壤因子和AM真菌alpha多樣性指數的影響,分析之前用“stats”包“shapiro.test”函數進行正態性檢驗,不符合要求的數據進行1次或2次乘方、開方、log或 Box-Cox轉化,若轉化后仍不滿足正態分布,則采用“friedman.test” 函數進行Friedman檢驗。

施N方式和施N速率對AM真菌群落組成的影響及不同處理間的兩兩比較,均采用 “vegan” 包“adonis2” 函數進行PERMANOVA分析,距離矩陣為“Bray-Curtis”距離,置換次數設為9999 次。為了實現數據的可視化,使用“vegan”包“metaMDS”函數進行NMDS分析并作圖。

2 結果

2.1 施氮對土壤理化性質的影響

在2013年,施N速率對土壤pH值有顯著影響(P=0.024)。兩個施N速率與對照相比,pH值均顯著降低,但是兩個施N速率之間沒有顯著差異。施N方式對土壤pH沒有顯著影響(P=0.826),而且施N方式和施N速率之間也沒有顯著交互作用(P=0.929)(表1)。對于其他土壤性質而言,施N方式、施N速率的影響及二者交互作用均不顯著(表1)。在2014年,施N方式和施N速率對所有土壤性質參數均無顯著影響(表1)。在2015年,施N方式顯著影響了土壤pH值(P=0.021)(表1),林下施N土壤pH值(4.21)顯著低于林冠施N處理(4.35)。對于其他土壤性質而言,施N方式、施N速率的影響以及二者交互作用均不顯著(表1)。2016年和2013年結果基本相同。

表1 施N方式和施N速率對土壤性質的影響

2.2 高通量測序基本信息及AM真菌OTUs分類情況

對連續4 a共80個土壤DNA樣品進行高通量測序,初步得到761939條序列,劃分為661個OTUs。經過嚴格篩選以后,最終確認AM真菌的OTUs為181個,共604890條序列,隸屬于1門,1綱,4目,8科,9屬,50VT(virtual taxa)。其中,絕大多數的OTUs和序列屬于Glomus屬,其次為Acaulospora屬(圖1)。OTUs的代表序列已上傳到Genbank數據庫(MN559107-MN559287)。序列數過少的3個樣品(2014年區組3的CN50處理 33條；2015年區組1的UN50處理 194條； 2016 年區組4的UN25處理 60條),在后續的分析中沒有被包括進來,其余樣品的序列數均多于1957條。

圖1 所有土壤樣品AM真菌序列和操作分類單元的分布情況 Fig.1 The proportional distributions of AM fungal sequences and derived AM fungal OTUs detected in all soil samples

2.3 施氮對AM真菌alpha多樣性指數和群落組成的影響

從2013年到2016年,施N方式、施N速率及二者之間的交互作用對AM真菌alpha多樣性指數都沒有顯著影響(表2)。隨著處理時間的延長,不同處理下AM真菌的alpha多樣性指數有趨同的趨勢(表2)。

表2 不同年份下施N方式和施N速率對AM真菌alpha多樣性指數的影響

在2013年,施N方式對AM真菌群落組成有輕微影響(P=0.052),而施N速率有極顯著的影響(P=0.004),且二者之間有顯著交互作用(P=0.045)(表3)：施N速率為25 kg hm-2a-1時,林冠施N(CN25)與對照差異不顯著(P=0.115),林下施N(UN25)與對照差異極顯著(P=0.005),且林冠施N(CN25)和林下施N(UN25)相比,群落組成差異極顯著(P=0.002)(表4,圖2)；當施N速率為50 kg hm-2a-1時,林冠施N(CN50)、林下施N(UN50)及對照三者之間均無顯著差異(表4,圖2)。從2014年到2016年,施N方式和施N速率對AM真菌群落組成都沒有顯著影響,雙因素交互作用也不顯著(表3,圖2)。

表3 不同年份施N方式和施N速率對AM真菌群落組成的影響

圖2 不同處理下AM真菌群落組成Fig.2 The variation of AM fungal community composition among different treatments不同顏色的橢圓代表不同處理下95%的置信區間;CK: 對照；CN25: 林冠施N 25 kg hm-2 a-1；CN50: 林冠施N 50 kg hm-2 a-1；UN25: 林下施N 25 kg hm-2 a-1；UN50: 林下施N 50 kg hm-2 a-1

2.4 AM真菌alpha多樣性指數和群落組成的變化與土壤因子變化之間的關系

在目前的時間尺度下,AM真菌alpha多樣性指數與土壤因子之間沒有顯著的相關性(表5)。在2013年,AM真菌群落組成的變化與土壤pH呈顯著正相關關系(表6),與其他土壤因子之間無顯著相關關系,而從2014年到2016年,所有土壤因子與AM真菌群落組成之間的相關性均未達到顯著水平(表6)。

表5 所有樣品AM真菌alpha多樣性指數與土壤因子之間的Pearson 相關性分析

3 討論

3.1 氮沉降對土壤理化性質的影響

之前的meta分析表明,不論是在區域尺度上[52],還是在全球范圍內[53],溫帶森林生態系統土壤pH值對N沉降的響應都十分敏感。對于我國森林生態系統來說,N沉降速率<30 kg hm-2a-1也會顯著降低土壤pH值[52]。我們的研究也支持此觀點,因為在2013年和2016年,低N處理(25 kg hm-2a-1)與對照處理相比,pH值有顯著下降。同時,高N(50 kg hm-2a-1)處理與對照相比,pH值也有顯著下降,但與低N處理(25 kg hm-2a-1)相比,并無顯著差異,這可能是由于本研究區域土壤pH背景值較低造成的。因為Tian 等[53]meta分析表明,土壤pH值的背景值越低,對N沉降的響應越不敏感。而本研究區域的初始pH值為弱酸性(5.0—6.0),所以盡管施N速率增加一倍,土壤pH值并沒有很大的改變。

在2015年,林下施N土壤pH值與林冠施N處理相比顯著降低,這與Huang等[40]研究結果一致。這一現象說明在特定條件下,林下施N會高估自然N沉降對土壤環境的影響。

3.2 氮沉降對AM真菌alpha多樣性的影響

在目前的時間尺度下(4 a),施N方式、施N速率對AM真菌物種alpha多樣性指數都沒有顯著影響,且二者也沒有顯著交互作用,說明在目前的N素添加水平和時間尺度下,林下施N并沒有高估自然N沉降對AM真菌alpha多樣性的影響。盡管施N以后土壤pH值有顯著下降,但是pH值的變化并沒有對AM真菌alpha多樣性造成影響。土壤pH值與AM真菌的alpha指數沒有明顯關系(表5),這與之前該試驗平臺的研究結果相符[32]。此外,之前的研究還發現,土壤N/P比與AM真菌的豐富度和香儂指數關系密切[32],而在目前的時間尺度下,施N方式和施N速率都沒有明顯改變土壤N/P比(表1)。我們推測這可能是AM真菌alpha多樣性對N沉降沒有響應的原因之一。隨著處理時間的延長,幾種試驗處理下AM真菌alpha多樣性有趨同的趨勢(表2),這可能是森林生態系統土壤AM真菌對持續N素輸入產生了適應,也可能和N素添加濃度有關。例如,劉永俊等[54]研究發現,低量施肥(30 g/m2(NH4)2HPO4)對垂穗披堿草(Elymusnutans)根系中AM 真菌物種豐富度沒有顯著影響,而當施肥量達到為120 g/m2時,施肥表現出極其顯著的負面作用。對于土壤真菌來說,N素添加帶來的影響還受到試驗持續時間的影響[33],如Van Diepen等[25]研究發現,在美國北部森林中,經過連續12年的N素添加,區域A的AM真菌香儂指數有輕微的增加,而區域C有輕微的下降。本研究時間跨度為4 a,那么在更大的時間尺度上,N沉降是否會對 AM真菌alpha多樣性產生顯著影響還值得進一步研究。

3.3 氮沉降對AM真菌群落組成的影響

在試驗早期(2013年),施N方式對AM真菌的群落組成有輕微影響,而且受到施N速率的制約：當施N速率較低(25 kg hm-2a-1)時,林下施N對AM真菌群落組成的影響大于林冠施N,支持了我們的假設；而當施N速率較高(50 kg hm-2a-1)時,兩種施N方式都沒有顯著改變AM真菌群落組成,與我們的假設不一致。這些結果說明在特定試驗條件下,林冠施N比林下施N能更好地反應自然N 沉降對AM真菌群落組成的影響,與Huang等[40]的研究結論相似。冠層對N的截留會影響到達地面的N的數量[39],截留的百分比和生態系統類型、N沉降量及研究區域土壤特征有關,少則10%以下,多則70%—80%[41]。在本試驗樣地內,林冠噴灑的N被冠層截留大概占到一半左右[55],在短時間內,林冠噴灑的N只有一半左右直接到達林下。所以林冠施N 25 kg hm-2a-1(CN25),大致相當于林下施N 12.5 kg hm-2a-1,林冠施N速率為50 kg hm-2a-1(CN50),則大概相當于林下施N 25 kg hm-2a-1(UN25),如此施N方式的問題就基本簡化為林下不同施N速率的問題。在Jiang等[56]的研究中,隨著施N速率的增加,N添加對AM真菌群落組成的影響也越大。在本研究中,CN25、CN50、UN25與對照相比,P值依次為0.115,0.080,0.005,基本上與Jiang等[56]的研究結果相一致,但是UN50與對照相比差異卻不顯著(P=0.480),這有可能是因為試驗處理重復次數較少,組內的差異可能掩蓋了組間差異(圖2),所以在空間異質性較大的環境條件下進行控制試驗時,需要盡可能地增加重復次數。

從2014年到2016年,不同試驗處理之間AM真菌群落組成差異不顯著,可能有兩方面的原因：(1)AM真菌對N素添加產生了一定程度的適應；(2)試驗處理時間還不夠長。Van Diepen等[25]研究還發現,經過連續12年的慢性N沉降,楓木 (Acerspp.)根中AM真菌的群落組成發生了顯著的改變,因此在更長的時間尺度上,施N是否會對土壤AM真菌群落組成產生影響還需要后續研究。

4 結論

本試驗條件下,施氮對落葉闊葉混交林土壤AM真菌alpha多樣性沒有顯著影響,但在試驗早期施氮對AM真菌的群落組成產生一定的影響,林下施氮高估了自然氮沉降對AM真菌群落組成的影響。隨著處理時間的延長,不同試驗處理下AM真菌群落有趨同趨勢,這可能是因為AM真菌群落對N沉降產生了適應。本研究評估了不同施N方式對森林生態系統土壤AM真菌的影響,考慮到實驗條件的局限性,在未來的研究中需要考慮更多的N素添加梯度和更長的時間跨度,才能夠更全面的認識氮沉降的生態效應。