腎衰靈方作用于SHH信號通路對UUO大鼠腎間質纖維化的影響＊

駱 言，劉 洪，黎 穎＊＊，宋 娜，熊維建，張 玲，丁偉森

（1. 重慶市中醫院腎病科 重慶 400021；2. 重慶市中醫院腫瘤科 重慶 400021）

目前慢性腎臟病（Chronic kidney disease，CKD）全球發病率約為10%-15%，如何防治CKD 已成為全球醫療系統需面臨的巨大挑戰[1-2]。腎間質纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是各種CKD 進展到終末期腎病的共同途徑和病理特征，如何減輕RIF 對于延緩CKD 進程具有重要意義[3]。根據我科多年臨床經驗結合國醫大師鄭新中醫理論及有效醫案3000 余份總結[5]，腎衰靈方在臨床治療慢性腎臟病效果顯著。腎衰靈方治療慢性腎衰的作用靶點及作用機制需要進一步研究論證。

近年研究發現音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）信號通路在RIF 中發揮重要作用[6-10]。本實驗采用單側輸尿管梗阻（Unilateral ureterul obstruction，UUO）大鼠模型模擬RIF，觀察在腎衰靈方作用下，RIF 的病理變化以及SHH 信號通路中SHH、神經膠質瘤相關癌基因同源蛋白-1（Glioma related cancer gene homologous proteins 1，Gli1）、鋅指轉錄因子（Snail Family Zinc Finger 1，Snai1）蛋白表達水平，探討腎衰靈方通過抑制SHH信號通路改善RIF的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及細胞

SPF 級 雄 性 SD 大 鼠 共 80 只 ，7 周 齡 ，體 質 量（200±20）g，購自重慶醫科大學動物實驗中心，動物許可證號：SCXK：2012-0001。

1.2 實驗藥物

腎衰靈方由中藥飲片大黃、黨參、黃芪、生龍牡、紅花、菌靈芝、當歸、丹參，淫羊藿，蒲公英等組成，經高壓滅菌密封制成（濃縮為含生藥1.2 g·mL-1）。本課題組用于研究的腎衰靈方由上訴飲片組成，由重慶市中藥研究所加工而成。

1.3 試劑及儀器

兔抗鼠SHH 多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司），兔抗鼠Gli1 多克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology 公司），鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（美國Affinity Biosciences 公司），兔抗鼠Snail單克隆抗體（英國Abcam 公司），大鼠結締生長因子（CTGF）PCR 試劑盒，ECL 發光試劑盒（碧云天生物科技有限公司），PVDF膜（美國Millipore公司），引物及GAPDH（上海生工生物有限公司）。AU400 全自動生化分析儀（日本OLYMPUS 公司）；BX51T-PHD-J11 型顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；80-2 型低速離心機（上海手術器械廠）；圖像采集系統CMOS（日本OLYMPUS 公司），Image-Pro Plus（美國Media Cybernetics公司）等。

1.4 大鼠分組和造模

1.4.1 分組

SPF 級雄性SD 大鼠，采用隨機數字表法將50 只SD 大鼠隨機分為5 組：假手術組、模型組、腎衰靈方低劑量組、腎衰靈方中劑量組、腎衰靈方高劑量組，每組10只。假手術組模型制備：大鼠經10%水合氯醛麻醉后，采用左側背部切開腹腔，鈍性分離左側輸尿管，再分層縫合關閉腹腔。UUO 模型制備：大鼠經10%水合氯醛麻醉后，采用左側腹部切開腹腔，鈍性分離左側輸尿管，于中上1/3 處以4-0 線雙重結扎后切斷輸尿管，分層縫合關閉腹腔。腎衰靈組將UUO模型大鼠按照《實驗藥理學》換算大鼠用藥量，低中高劑量組分別予以 5 mg·kg-1，15 mg·kg-1，25 mg·kg-1劑量進行灌胃，分別相當于成人臨床劑量5 倍、10 倍、15 倍，持續治療14天。假手術組及模型組予以蒸餾水按15 mg·kg-1劑量進行灌胃。

根據結果選取腎衰靈療效最佳劑量組，再次采用隨機數字表法將30 只SD 大鼠隨機分為3 組：假手術組、模型組、腎衰靈方組，每組10只。

1.4.2 血液生化指標檢測

造模治療14天后，禁食禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，心臟取血，常溫靜置1 h，3 500 r·min-1離心5 min，取上清液以備用，根據全自動生化分析儀測定血清血清尿素氮（BUN），肌酐（SCr），谷丙轉氨酶（ALT），谷草轉氨酶（AST），堿性磷酸酶（ALP），乳酸脫氫酶（LDH）含量。

1.4.3 Masson染色觀察膠原纖維沉積

石蠟切片后按試劑說明行馬松（Masson）染色，脫水、透明，中性樹膠封片，觀察腎組織病理學改變。400倍光鏡下，每張切片隨機選擇10個不重疊視野，細纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色，用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定其陽性（藍色）區域面積與該視野下總面積（除去腎小管管腔），以二者百分比計算腎間質膠原纖維沉積率。

1.4.4 Real-time PCR 檢測CTGF的表達

將Trizol法提取的組織RNA用紫外分光光度計測定濃度后，取2 μg 總RNA 進行逆轉錄。采用DNA Engine OpticonTM實時熒光定量 PCR 儀以 20 μL 反應體系進行PCR 擴增，以β-Actin 為內參照。采用RESTXL 軟件作基因表達的相對定量分析。引物如下：CTGF-F：5’-CGT ACC ATA TGT TCT GAC AG-3’，CTGF-R：5’-GAA AGA CAG GTA CTA GCT GA-3’；β-Actin-F：5’-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3’，β-Actin-R：5’-GCTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3’。

1.4.5 免疫印跡試驗（Western blot）檢測各組大鼠腎組織SHH、Gli1、Snail蛋白表達情況

根據血清學指標及Masson 染色結果，我們選擇治療效果最佳的腎衰靈組繼續行WB實驗。提取腎組織蛋白，蛋白定量后上樣、電泳、轉膜，分別加入I 抗（1∶1 000），搖床4℃孵育過夜，加 II 抗（1∶2 000），37℃孵育 120 min，ECL 顯色，暗室曝光成像，采用Image J 圖像分析灰度值，計算目的蛋白和GAPDH 條帶吸光值的比值反應目的蛋白的表達水平。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清學指標含量

腎功能：與假手術組比較，模型組和腎衰靈各劑量組SCr 和BUN 水平均明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，腎衰靈各劑量組SCr和BUN水平均明顯降低，其中腎衰靈中劑量組SCr和BUN水平最低（P<0.05）。

肝功能：各組間ALT、AST、ALP、LDH 水平無顯著差異（P>0.05），提示腎衰靈各劑量組安全性良好。（見表1）。

2.2 腎組織解剖觀察

假手術組腎臟大小正常，暗紅色質軟；模型組左側腎臟明顯腫脹增大，暗褐色，包膜緊張，切開內可見渾濁積液，腎盂腎盞擴張變形，腎皮質較正常組明顯變薄；腎衰靈高、中、低劑量組腎臟腫脹，暗褐色，腎皮質較模型組稍厚。

2.3 Masson染色觀察腎組織纖維化

Masson 染色后結果顯示假手術組大鼠腎小球基底膜、系膜、及小管周圍間質僅有少量間質膠原沉積，模型組腎小球數量明顯減少、腎小球嚴重萎縮，炎性細胞彌漫浸潤，大量間質膠原纖維環狀沉積于腎小球上皮組織、基底膜區等，提示模型組大鼠腎間質纖維化明顯，腎衰靈方治療組，腎間質膠原沉積較模型組明顯減輕，提示腎間質纖維化明顯改善。在200 倍鏡下隨機選取5 個不相重疊的腎小管間質視野，分別測量每個視野中腎小管間質纖維化的相對面積，取平均值進行半定量分析，計算腎間質膠原纖維沉積率，結果顯示，與假手術組相比（0.54±0.04），模型組（8.57±1.49），腎衰靈低劑量組（3.95±0.92），腎衰靈中劑量組（2.67±0.54），腎衰靈高劑量組（3.05±1.04），與假手術組相比，其余各組膠原纖維沉積率明顯增高（P<0.01）。與模型組相比，腎衰靈高中低組膠原纖維沉積率明顯降低（P<0.01），其中腎衰靈中劑量組效果最佳（圖1）。

2.4 real-time PCR檢測CTGF表達情況

與假手術組比較，模型組CTGF mRNA 表達顯著上調（P<0.01），與模型組比較，腎衰靈方高、中、低劑量組中CTGF mRNA 表達顯著下降（P<0.01），與高劑量組及低劑量組比較，中劑量組CTGFmRNA表達顯著下調（P<0.05），見表2。

2.5 Western blot 檢測各組大鼠腎組織SHH、Gli1、Snail蛋白表達情況

根據血清學指標及Masson 染色結果，我們選擇腎衰靈中劑量組進一步檢測SHH 及其下游信號分子蛋白表達水平。Western blot 結果顯示，與假手術組比較，模型組腎組織內SHH，Gli1，Snail 蛋白的表達較假手術組顯著增強（P<0.05），與模型組比較，腎衰靈組腎組織中SHH，Gli1，Snail 蛋白的表達明顯下降（P<0.05）（圖2，表3）。

3 討論

腎衰靈方是國醫大師鄭新在臨證60 余載經驗效方，鄭老精通中醫四大經典，融古通今，善于運用健脾補腎、活血化瘀、搜風通絡等方法治療腎臟相關疾病。鄭老認為脾腎虧虛為起病之本，故治療腎臟疾病多采用補益脾腎為基礎。慢性腎臟病病程較長，患者脾胃虧虛，故口服藥物吸收欠佳，鄭老根據臟腑理論為基礎，總結出臟病治腑，瀉腑以補臟，即六腑以通為補。腎衰靈方以大黃為君藥，通腑瀉濁，活血化瘀，龍骨、牡蠣收斂固澀，與大黃配伍散中有收，防止大黃瀉下傷正，另外慢性腎臟病久病體虛，一味攻伐忽視其本虛，或可取一時之效，療效難以持續，日久反使正氣更虛，故方中加黨參、黃芪、菌靈芝補氣扶正以化生氣血，淫羊藿補益腎陽，紅花、當歸、丹參活血養血，蒲公英苦以開泄，利濕散結，為引經之藥。本方充分反映了鄭老重視脾腎、益氣養血、活血化瘀的治療法則。腎衰靈方保留灌腸在臨床治療慢性腎臟病效果極佳，可明顯延緩慢性腎臟病患者進入血液透析治療，提高患者生活質量。臨床上，SCr 及BUN 通常被稱作腎功能排毒不佳的標志，可根據SCr 及BUN 對慢性腎臟病患者進行臨床分期，是評估慢性腎臟病發病及發展最簡單有效的經典指標。課題組臨床中根據患者血清檢驗可測得運用腎衰靈方灌腸治療一個療程的患者血清中SCr及BUN可得到明顯下降。根據本實驗結果顯示，假手術組大鼠血清中SCr及BUN正常，說明假手術組大鼠腎功能正常未受假手術影響。UUO 大鼠模型組血清中SCr 及BUN 明顯升高，提示腎間質纖維化大鼠腎功能受到明顯損害，模型大鼠造模成功，而腎衰靈方組大鼠血清中的SCr 及BUN 明顯降低，能降低模型大鼠血清中SCr 及BUN，提示腎衰靈方對模型大鼠腎臟功能有保護作用，能有效地降低模型大鼠血清中的腎衰指數。

表1 各組大鼠SCr、BUN含量比較（，n=10）

表1 各組大鼠SCr、BUN含量比較（，n=10）

注：*P<0.05與假手術組比較，#P<0.05與模型組比較，△P>0.05與假手術組比較。

LDH/U·L-1 181.33±12.79 174.67±13.94△173.67±845△170±8.81△170.83±12.79△組別假手術組模型組腎衰靈低劑量組腎衰靈中劑量組腎衰靈高劑量組Crea/μmol·L-1 34.11±2.23 52.82±9.13*42.63±8.12#40.30±8.01#43.30±8.61*#BUN/mmol·L-1 4.41±0.69 7.35±1.62*5.68±0.96*#5.27±0.44*#6.10±1.44*#ALT/U·L-1 261.17±40.33 265.5±30.93△260±41.53△255.17±38.03△279.17±32.34△AST/U·L-1 79.17±8.38 74.17±11.72△69.83±8.89△77±10.26△75.5±9.57△ALP/U·L-1 132.5±17.22 140.5±11.61△136±16.57△134.5±17.04△135.67±21.29△

圖1 各組大鼠腎臟組織Masson染色（×200）

表2 腎衰靈方對各組大鼠腎組織CTGFmRNA表達的影響（，n=10）

表2 腎衰靈方對各組大鼠腎組織CTGFmRNA表達的影響（，n=10）

注：*P <0.01 與假手術組比較，#P <0.01 與模型組比較，與腎衰靈方中劑量比較△P<0.05。

CTGF 0.375±0.033 1.093±0.051*0.758±0.052#△0.652±0.028#0.974±0.063#△組別假手術組模型組腎衰靈組高劑量組腎衰靈組中劑量組腎衰靈組低劑量組

圖2 Western Blot測得各組大鼠腎組織中SHH，Gli1，Snai1蛋白表達

表3 各組大鼠腎組織SHH、Gli1、Snai1蛋白表達情況（，n=10）

表3 各組大鼠腎組織SHH、Gli1、Snai1蛋白表達情況（，n=10）

注：*P<0.05與假手術組比較，#P<0.05與模型組比較。

Snai1 0.323±0.132 1.235±0.217*0.841±0.961*#組別假手術組模型組腎衰靈組SHH 0.554±0.191 1.634±0.372*1.039±0.188*#Gli1 0.214±0.117 1.269±0.121*0.717±0.078*#

臨床上慢性腎臟病腎組織解剖相對較少，彩超等檢查可見腎組織皮質變薄。模型大鼠腎組織解剖觀察可見：假手術組腎臟大小正常，暗紅色質軟；而模型組左側腎臟明顯腫脹，暗褐色，包膜緊張，切開內可見渾濁積液，腎盂腎盞擴張變形，腎皮質較正常組明顯變薄，提示腎間質纖維化模型大鼠造模成功；而腎衰靈組腎臟腫脹，暗褐色，腎皮質較模型組稍厚提示在運用腎衰靈方作用的模型大鼠腎組織損傷有所緩解，提示腎臟疾病進程較模型大鼠有所減緩。腎臟Masson 染色中顯示腎小球數量明顯減少、腎小球嚴重萎縮，炎性細胞彌漫浸潤，大量間質膠原纖維環狀沉積于腎小球上皮組織、基底膜區等，提示模型組大鼠腎間質纖維化明顯，腎衰靈方治療各組腎間質膠原沉積較模型組明顯減輕，提示腎間質纖維化明顯改善。從微觀角度證明造模成功，另外腎衰靈方可以改善模型大鼠腎功能，改善模型大鼠腎間質纖維化情況，根據血清學及病理學評估腎衰靈方中劑量組效果最佳。通過肝功相關指標檢測，提示腎衰靈方安全性良好，不會引起肝功能異常。

腎間質纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是各種慢性腎臟病進展到終末期腎病的共同途徑和病理特征，在此過程中有效腎單位逐漸喪失、腎功能進行性下降。研究證實RIF嚴重程度與腎功能下降程度密切相關，是一項決定預后的有效指標。研究提示，結締生長因子（Connective tissue growth factor，CTGF）是一種可刺激成纖維細胞增殖和分泌膠原蛋白的生長因子，在RIF進程中發揮重要作用[12-14]。CTGF的檢測，可以看出腎衰靈方各劑量組相較模型組大鼠均有治療作用，其中中劑量組大鼠CTGF 的表達最低，提示纖維細胞增殖相對受到抑制。另有研究發現在各種原因所致慢性腎臟病（Chronic kidney disease，CKD）患者中SHH 在腎小管上皮細胞表達明顯上調；這一結果在各種大鼠腎纖維化模型中也被證實，這提示SHH 信號通路激活是各種腎臟疾病的共同病理結果[15]。經典SHH 信號通路活化途徑為SHH 經過自動的催化裂解后與細胞膜受體跨膜蛋白Patched（Ptch）結合，解除對Smoothened（SMO）的抑制，SMO 解除了 Gli1 磷酸化等過程，從而使Gli1 以全長形式入核啟動對靶基因的轉錄[16]，其中Gli1 是SHH 信號通路的重要的多功能轉錄因子，其激活使反應SHH 信號通路活性的可靠指標。SHH-Gli1 通路通過促進細胞增殖參與RIF 發生發展[17-18]。通過大鼠基因敲除Gli1-LacZ 揭示SHH-Gli1通路是腎纖維化必不可少的信號通路[19]。研究表明Snai1 具有介導細胞間充質轉化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）的作用，廣泛參與發育、腫瘤、纖維化過程[20]。EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，研究表明EMT 在RIF 的發病機制中同樣起到關鍵作用[21-24]。最近研究發現SHH/Gli1 通路可誘導轉錄因子Snai1 的表達[25]，國外學者研究發現活化SHH/Gli1 可通過調控轉錄因子Snai1表達，精密調控EMT 的發生[26-27]。由此可假設SHH-Gli1-Snai1 信號通路是腎組織在EMT 過程中導致RIF 的信號通路。綜上，若阻斷SHH 信號通路，則SHH 的表達下降，則下游信號通路分子Gli1 及Snai1也會隨之下降。據此，我們假設腎衰靈方阻止腎臟細胞纖維化是通過阻斷SHH 信號通路實現的，故設計本次三組對照實驗。模型組SHH、Gli1、Snai1 蛋白表達顯著升高，提示腎間質纖維化指標明顯升高，提示模型組大鼠腎間質纖維化明顯。且可能是大鼠腎間質纖維化的信號通路。而腎衰靈方組中SHH、Gli1、Snai1蛋白表達顯著降低，提示腎衰靈方能降低腎間質纖維化SHH、Gli1、Snai1 蛋白指標的表達，提示腎衰靈方可能通過抑制SHH、Gli1、Snai1 的表達從而抑制腎間質纖維化。而SHH、Gli1、Snai1 蛋白的表達上升與下降方向明顯相同，提示SHH-Gli1-Snai1信號通路存在，腎衰靈方對模型大鼠纖維化指標改善明顯，提示腎衰靈方可能作用于SHH-Gli1-Snai1 三種蛋白構成的信號通路有明顯的抑制作用。綜上所述，腎衰靈方可能通過抑制SHH-Gli1-Snai1 信號通路阻斷EMT 抑制腎臟RIF。根據此，我們將開展細胞實驗，將腎衰靈含藥血清作用于腎間質纖維化細胞，進一步深入研究腎衰靈方對腎臟細胞纖維化的作用機制。