胃腸道間質(zhì)瘤胰島素樣生長因子1受體表達(dá)水平與伊馬替尼耐藥的相關(guān)性

王炯元， 童漢興， 姜 銓， 侯英勇， 陸維祺*

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普通外科，上海 200032 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)起源于Caja細(xì)胞，是消化系統(tǒng)最常見的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤總數(shù)的1%～4%，每年發(fā)病率約為2/10萬[1-2]。GIST可發(fā)生在消化系統(tǒng)的任何部位，其中以胃(60%)和小腸(30%)最常見[3-4]。肝轉(zhuǎn)移和腹腔播散是GIST臨床上最常見的惡性表現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少見。c-Kit基因及血小板衍生生長因子受體α(platelet-derived growth factor receptor alpha，PDGFRα)基因的功能獲得性突變是GIST發(fā)病的主要機(jī)制[5]。75%～80%GIST存在c-Kit基因突變，5%～10%GIST伴PDGFRα基因突變[6]，10%～15%GIST既無PDGFRα基因突變也無c-Kit基因突變，被稱為野生型GIST。一部分野生型GIST患者伴SDH基因改變，被稱為SDH缺陷型，也有極少數(shù)病例存在NF-1、BRAF等其他基因的罕見突變[7]。

甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate，IM)是一種選擇性酪氨酸激酶抑制劑，自2002年獲得美國FDA批準(zhǔn)以來，已成功應(yīng)用于治療轉(zhuǎn)移性和(或)無法切除的GIST患者，同時也用于高危復(fù)發(fā)風(fēng)險患者的術(shù)后輔助治療。隨著藥物的臨床應(yīng)用，其耐藥問題也日益彰顯，10%～15%患者存在原發(fā)耐藥，40%～50%患者在2年內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥[8]。SDH缺陷型GIST患者多表現(xiàn)為原發(fā)耐藥。繼發(fā)性耐藥的可能機(jī)制則包括c-Kit和PDGFRα基因的二次突變、基因擴(kuò)增、下游信號通路的異常活化、IM血藥濃度及細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的改變等[9]。IM耐藥機(jī)制尚未被完全闡明，可能是多個機(jī)制共同作用的結(jié)果。因此，IM耐藥是目前GIST臨床治療的難點，也是當(dāng)下臨床研究的熱點。

胰島素樣生長因子家族(insulin-like growth factors，IGFs)由胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2， IGF-2)、胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)、胰島素受體(insulin receptor，IR)及6個胰島素生長因子結(jié)合蛋白(IGF-binding proteins，IGFBPs)組成[10]。IGFs在細(xì)胞分化、增殖及個體的生長發(fā)育中具有重要的促進(jìn)作用[11-12]，也與腫瘤形成及發(fā)展密切相關(guān)。Tarn等[13]報道，野生型GIST中IGF1R的表達(dá)高于c-Kit/PDGFRα突變型標(biāo)本，提示IGF1R可能是原發(fā)性耐藥患者的潛在治療靶點。因此，本研究回顧性分析復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的134例GIST組織IGF1R的表達(dá)水平與IM耐藥的關(guān)系，探討IGF1R對IM耐藥GIST患者預(yù)后的潛在價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008年1月至2014年1月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普通外科收治的經(jīng)病理確診的GIST患者的臨床及病理資料。將所有病例術(shù)后組織石蠟切片制作組織芯片用于免疫組化染色。患者出院后通過門診及電話隨訪患者生存情況。本研究患者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 免疫組化法檢測組織芯片中IGFR蛋白的表達(dá) IGFR檢測采用免疫組織化學(xué)法。組織芯片使用二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液(無水、95%、75%)脫水，TBS沖洗。檸檬酸抗原修復(fù)液處理后加入3%雙氧水阻斷其內(nèi)源性過氧化物酶。沖洗后用10%山羊血清孵育30 min。移去血清，滴加按1∶150稀釋的兔抗人多克隆IGF1R抗體(Abcam公司，美國)4℃孵育。沖洗后滴加生物素標(biāo)記二抗(EnVision抗兔IgG試劑盒，Dako公司，丹麥)，室溫孵育30 min后移去二抗，滴加新鮮配制的DAB顯色并使用蘇木精對比染色。梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，封片劑封片后鏡檢。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀 以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合計分，組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色者為陽性細(xì)胞。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性(染色深淺需與背景著色相對比)計分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比即光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5個高倍視野(×400)，每個視野中計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，取陽性細(xì)胞平均數(shù)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色結(jié)果為染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性()，9～12分為強(qiáng)陽性()。評分<5分為IGF1R低表達(dá)，≥5分為IGF1R高表達(dá)，以上結(jié)果由2位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生完成。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，生存分析的組間比較采用log-rank檢驗，采用Cox風(fēng)險比例回歸模型對IM耐藥患者行預(yù)后危險因素分析。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 GIST患者不同臨床病理特征下IGF1R蛋白表達(dá)差異 結(jié)果(表1)顯示：GIST組織IGF1R蛋白表達(dá)水平在不同性別、年齡、腫瘤大小、原發(fā)部位、核分裂相、突變基因、NIH危險度分級組間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；IM耐藥患者GIST組織IGF1R蛋白的表達(dá)率(73.08%)高于非IM耐藥患者(41.67%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.286，P=0.004)，提示IGF1R高表達(dá)可能與GIST患者IM耐藥相關(guān)。圖1示GIST標(biāo)本病理結(jié)果。

表1 不同IGF1R蛋白表達(dá)水平GIST患者臨床病理特征的對比 n(%)

圖1 GIST組織不同IGF1R蛋白表達(dá)水平的免疫組化及H-E染色

2.2 生存分析 中位隨訪64.5(1～96)個月，134例患者中9例患者失訪，27例患者死亡。26例IM耐藥患者中2例失訪，12例死亡。26例IM耐藥患者預(yù)后風(fēng)險的單因素分析結(jié)果(表2，圖2)顯示：IGF1R的表達(dá)水平與總生存時間相關(guān)，IGF1R高表達(dá)患者總生存時間短于IGF1R低表達(dá)患者(35.3vs71.3個月，P=0.04)。多因素分析結(jié)果(表3)表明：腫瘤原發(fā)部位、IGF1R表達(dá)水平是影響IM耐藥患者總生存時間的獨立危險因素。

表2 IM耐藥GIST患者預(yù)后的單因素分析

圖2 不同IGF1R表達(dá)IM耐藥GIST患者預(yù)后分析

表3 IM耐藥GIST患者預(yù)后的多因素分析

3 討 論

IGF1R是一種跨膜受體酪氨酸激酶，可結(jié)合其配體IGF-1和IGF-2而被激活，并通過活化下游信號通路，包括磷脂酰肌醇3激酶-蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K-Akt)信號通路及絲裂原活化蛋白激酶(MAKP)通路，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。近年來，IGFs在GIST發(fā)生發(fā)展中的作用也引起了關(guān)注。Tarn等[13]報道相對于c-Kit/PDGFRα突變型GIST，野生型GIST中IGF1R的表達(dá)顯著升高，而野生型GIST往往表現(xiàn)為原發(fā)性耐藥。而IGF1R是否參與了胃腸道間質(zhì)瘤IM耐藥目前尚不清楚。

本研究中，在IM耐藥患者GIST組織IGF1R蛋白表達(dá)顯著高于非耐藥患者，由此推測IGF1R可能參與IM耐藥的產(chǎn)生。Codony-Servat等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中細(xì)胞核IGF1R的高表達(dá)可能導(dǎo)致化療及靶向藥物耐藥的產(chǎn)生。近年來多個針對IGF1R的靶向藥物已陸續(xù)進(jìn)入臨床試驗，現(xiàn)有證據(jù)表明目前抗IGF1R治療最大的作用在于預(yù)防或逆轉(zhuǎn)傳統(tǒng)治療耐藥。并且相較于單獨應(yīng)用，抗IGF1R治療聯(lián)合化療或靶向治療能增加獲益[15]。Chen等[16]在IM耐藥細(xì)胞系(GIST430和GIST48)中使用linstinib(一種IR/IGF1R抑制劑)與IM聯(lián)合治療，分別導(dǎo)致IM GIST430和GIST48的生存力降低60%和80%；而在IM敏感的GIST882細(xì)胞系中聯(lián)合治療與IM單藥的效果相當(dāng)。因此，IGF1R可作為IM耐藥病例的潛在治療靶點。本研究中，針對26例IM耐藥患者的生存分析提示，IGF1R高表達(dá)患者總生存時間顯著縮短，推測在IM耐藥患者中IGF1R可作為預(yù)后不良的標(biāo)志。同時，多項臨床試驗發(fā)現(xiàn)，IGF1R高表達(dá)的患者能從抗IGF1R治療中獲益。Asmane等[17]發(fā)現(xiàn)在使用抗IGF1R治療的肉瘤患者中，IGF1R的核定位增加與良好的生存預(yù)后顯著相關(guān)，提示IGF1R的表達(dá)或可成為篩選患者及監(jiān)測治療反應(yīng)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，IM耐藥患者GIST組織中IGF1R的表達(dá)顯著增高，IGF1R高表達(dá)患者的總生存時間短于IGF1R低表達(dá)患者，提示IGF1R參與GIST IM耐藥的同時，或可作為IM耐藥患者的預(yù)后判斷指標(biāo)，并且可能是IM耐藥患者的潛在治療靶點。