LXRs過表達抑制高糖誘導的H9C2細胞炎癥反應及其機制

周江龍 王云開 歐陽先國 黃瑛

(1南昌市第三醫(yī)院，江西 南昌 330009；2南昌大學第一附屬醫(yī)院)

糖尿病心肌病(DCM)是以心室功能不全為主要表現(xiàn)的疾病，其獨立于高血壓、冠心病等，特點是心肌肥厚、心肌擴張、左心室舒張和收縮功能下降，最終進展為心力衰竭，是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一〔1〕。代謝紊亂、微血管病變、胰島素信號轉導異常、鈣離子調節(jié)失衡、心肌間質纖維化、心臟自主神經(jīng)病變及微RNA(miRNA)等多種因素參與DCM的發(fā)病，但尚未完全闡明〔2〕。高血糖是導致DCM的關鍵，長期高血糖不僅能直接引起心肌細胞的損害，還可通過使晚期糖基化終末產(chǎn)物、心肌細胞活性氧(ROS)的水平增加，激活核因子(NF)-κB，最終引起心肌肥厚和纖維化〔3〕。肝X受體(LXRs)是人體重要的核受體，在糖脂代謝、炎癥、凋亡中起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)LxRs可能在治療炎癥相關疾病中起重要作用，是一個重要治療靶點〔4〕。至今，尚未完全闡明DCM的發(fā)病機制，但在DCM的發(fā)生發(fā)展中炎癥反應起關鍵作用，研究LXRs能否通過抑制炎癥反應來改善DCM發(fā)生發(fā)展有重要意義。本實驗通過利用高糖誘導建立心肌細胞炎癥反應，分析過表達LXRs對心肌細胞炎癥反應的影響及其抗炎機制，為DCM的預防與治療提供新的治療靶點和實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 H9C2細胞(大鼠胚胎心肌細胞株)。低糖和高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國 Hyclone公司；含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶、葡萄糖粉購于美國Simga公司；CCK-8溶液購于上海碧云天生物技術有限公司；RT-PCR試劑盒、qPCR Mix購于美國GeneCopoeia公司；TRIzol reagent、PCR引物購于美國invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)、總蛋白提取試劑盒均購于Vazyme有限公司；兔抗NF-κB p65磷酸化抗體購于CST公司；SuperSignal West Femto trial kit購于美國Thermo Fisher公司。

1.2過表達LXRs慢病毒載體的構建和轉染 LXRs主要包括LXRα(Nr1h3)和LXRβ(Nr1h2)兩個亞型，按照試劑盒成功構建和轉染LXRs慢病毒載體，選擇(10、20、40、60)的感染復數(shù)(MOI)值在不同時間(24 h、48 h、72 h、96 h)感染H9C2細胞，后熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，確定最適MOI值和時間。

1.3實驗分組 對照組：H9C2細胞由低糖DMEM培養(yǎng)，無干預；高糖組：H9C2細胞由低糖DMEM培養(yǎng)同前，24 h后加入33 mmol/L高糖DMEM培養(yǎng)；③LXRα組：H9C2細胞由低糖DMEM培養(yǎng)同前，24 h后轉染LXRα過表達慢病毒，8 h后換液加入33 mmol/L高糖DMEM培養(yǎng)；④LXRβ：轉染LXRβ過表達慢病毒，余同LXRα組；⑤空載體組：轉染空病毒載體，余同LXRα組。

1.4CCK-8檢測細胞增殖抑制率 選擇對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后進行計數(shù)，在96孔板中加入細胞懸液，每組設6個復孔，每孔加入100 μl細胞懸液(5 000個細胞)，慢病毒轉染后72 h，每孔加入10 μl CCK-8，繼續(xù)在箱內(nèi)孵育0.5～4.0 h，后酶標儀測光密度(OD)值，后計細胞增殖抑制率=〔1-(處理組-空白對照)/(正常組-空白對照)〕×100%。

1.5qRT-PCR檢測細胞LXRα、LXRβ及炎癥因子人單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、白細胞介素(IL)-6、人腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA的表達 按產(chǎn)品說明書提取各組細胞總RNA，后逆轉錄合成cDNA。各取2 μl cDNA在20 μl反應體系進行PCR反應，共進行40個循環(huán)。根據(jù)公式2-ΔΔCt方法進行統(tǒng)計分析。

1.6Western印跡檢測細胞NF-κB p65磷酸化蛋白的表達 按產(chǎn)品說明書提取總蛋白，然后用BCA法測定蛋白濃度，取等量的蛋白質進行電泳及轉膜，加入Ⅰ抗和Ⅱ抗行免疫反應，最后化學發(fā)光，顯影。按試劑盒進行操作，得出NF-κB p65磷酸化蛋白表達。

1.7細胞免疫熒光檢測NF-κB p65核轉位 爬片準備，各組細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，固定，0.3% Triton破膜，1%BSA封閉，加入1%BSA稀釋的一抗(1∶100)，4℃孵育過夜，對照組用PBS代替一抗，加入1%BSA稀釋的二抗(1∶70)，染色，最后用熒光顯微鏡察看。

1.8統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1LXRα和LXRβ過表達慢病毒載體的構建和轉染 取不同的MOI值(10、20、40、60)在不同時間(24、48、72、96 h)感染大鼠胚胎心肌細胞株H9C2細胞，在熒光顯微連續(xù)鏡下察看，結果發(fā)現(xiàn)隨著轉染時間延長，細胞熒光表達增多，轉染24 h開始表達少量熒光，72 h熒光強度達最高峰；且最適MOI為40，見圖1，圖2。

2.2qRT-PCR檢測各組H9C2細胞LXRα和LXRβ mRNA的表達 慢病毒感染72 h后，LXRα、LXRβ組mRNA表達(40.527±1.847，31.187±1.605)明顯升高(P<0.01)，而空載體組(1.000)與對照組(1.000)無明顯差別(P>0.05)，提示過表達LXRα、LXRβ病毒載體均轉染。

2.3CCK-8檢測LXRs過表達慢病毒對細胞增殖抑制率的影響 高糖組增殖抑制率(47.67%±1.09%)顯著高于對照組(抑制率為0%作對照，P<0.01)；而與高糖組相比，LXRα組(11.08%±0.82%)和LXRβ組增殖抑制率(40.33%±1.32%)均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，且LXRα組降低更明顯(P<0.01)；空載體組(46.41%±1.12%)和高糖組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4qRT-PCR檢測MCP-1、IL-6、TNF-α mRNA的表達 與對照組(表達量為1)相比，MCP-1、IL-6、TNF-α mRNA表達在高糖組均明顯上調(P<0.01)；而在LXRα組和LXRβ組均顯著下調(P<0.05)，且LXRα組下調水平更明顯(P<0.01)；而高糖組與空載體組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.5Western印跡檢測各組H9C2細胞NF-κB p65磷酸化蛋白的表達 與對照組相比，NF-κB p65磷酸化蛋白表達在高糖組明顯上升(P<0.01)；與高糖組相比，NF-κB p65磷酸化蛋白的表達在LXRα組和LXRβ組均顯著下降(P<0.05)，且LXRα組下降更顯著(P<0.01)；而高糖組與空載體組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.6細胞免疫熒光檢測各組H9C2細胞NF-κB p65的核轉位 細胞免疫熒光檢測顯示大部分胞核表達較強的紅色熒光出現(xiàn)在高糖組(約75%)、空載體組(約75%)，而對照組胞核未見紅色熒光表達，LXRα組(約40%)和LXRβ(約68%)組表達紅色熒光。提示過表達LXRs(尤其是LXRα)可抑制由高糖引起的NF-κB p65的核轉位，進而降低其活性。見圖4。

圖1 不同MOI值病毒感染H9C2細胞72 h熒光表達情況(×100)

圖2 MOI=40時H9C2細胞感染病毒熒光表達情況(×100)

表1 慢病毒感染后各組H9C2細胞MCP-1、IL-6及TNF-α mRNA表達水平比較

圖3 Western印跡結果

圖4 慢病毒感染后各組H9C2細胞的NF-κB p65核轉位情況(×100)

3 討 論

DCM是指糖尿病患者出現(xiàn)了異常的特異性心肌結構和功能。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可以通過調節(jié)NF-κB等多種信號通路誘導心肌細胞中細胞因子、趨化因子和黏附分子分泌增加，導致炎癥產(chǎn)生〔5〕。Wenzel等〔6〕體外研究顯示30 mmol/L葡萄糖能引發(fā)一系列炎癥反應，可促進轉化生長因子(TGF)-β、心肌細胞P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)及活性氧簇(ROS)的形成，表明高糖與DCM的發(fā)生發(fā)展密切相關。本實驗結果提示，高糖環(huán)境可使心肌細胞出現(xiàn)炎癥反應。

LXRs屬于核受體超家族成員，包含LXRα和LXRβ兩種亞型，其中LXRα主要分布在肝臟，而LXRβ遍布全身組織〔7〕。且已證實，LXRs激活后具有抗炎效應，但其作用機制尚不明確，但已經(jīng)明確的抗炎機制包括有轉錄后水平調控、反式阻抑，及調控脂質代謝進而抑制炎癥因子表達〔7〕。LXRs激活后可抑制環(huán)氧合酶(COX)-2、TNF-α、基質金屬蛋白酶(MMP)-9及其他一些促炎因子等表達，其機制為抑制NF-κB 和激活蛋白(AP)-1的轉錄活性，進一步抑制脂多糖(LPS)介導的上述促炎因子的表達〔8〕。Xiao等〔9〕研究顯示，在LPS誘導的THP-1巨噬細胞中，LXRs 活化后可負性調控炎癥應答，其主要通過下調TNF-α、IL-1β 及IL-6等炎癥因子mRNA 的表達。

殷然等〔10〕在研究LXRs對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(A/R)損傷的影響，并進一步研究其細胞信號通路中發(fā)現(xiàn)，LXRs激動劑T0901317預處理后，可顯著降低心肌細胞的損傷，其機制與減輕心肌細胞A/R損傷引起的乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性升高，并顯著減少細胞炎癥因子釋放，進一步抑制NF-κB信號通路活化。但Mitro等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，LXRs激動劑T0901317在細胞和動物中不但有LXR靶基因，還有異生素受體孕烷X受體(PXR)，其激活后產(chǎn)生結果不同，所以并不能將其結果都歸因于LXRs。本實驗結果表明，高糖可激活NF-κB通路，而過表達LXRs(尤其是LXRα)可下調由高糖激活的NF-κB活性，同時細胞免疫熒光檢測也證實過表達LXRs(尤其是LXRα)可抑制由高糖引起的NF-κB p65的核轉位，進而降低其活性。

綜上，炎癥反應在DCM的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，而LXRs可通過抑制炎癥反應來改善DCM的發(fā)生發(fā)展。Zhang等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，LXRs激動劑T0901317在發(fā)揮抗炎的同時，還會出現(xiàn)LXRα活化引起的肝臟脂肪變性和高脂血癥。因此，很有必要尋求能避免引起肝脂肪變性和高脂血癥的特異性LXRs激動劑。