不同毒力結(jié)核分枝桿菌誘導小鼠樹突狀細胞凋亡差異分析

李 萍，李叢哲，吳利先

（1.河西學院醫(yī)學院，甘肅張掖 734000；2.華北理工大學附屬醫(yī)院兒科，河北唐山 063000；3.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000）

結(jié)核病（Tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）引起的傳染性疾病，每年約有1 040 萬新增病例，據(jù)統(tǒng)計至2019 年，其造成的死亡人數(shù)超過艾滋病和瘧疾〔1〕。約有10%結(jié)核病發(fā)展為活動性結(jié)核，其余多處于潛伏感染狀態(tài)，通過多種機制來逃避和操縱宿主的免疫應答〔2〕。Mtb逃避宿主天然免疫的機制包括胞漿逃逸、限制性抗菌肽的產(chǎn)生、吞噬體成熟的阻斷、細胞凋亡、自噬調(diào)節(jié)等，這些方式也限制了Mtb感染過程中適應性免疫反應的發(fā)展。Mtb感染很大程度上取決于與宿主固有免疫細胞早期的相互作用，參與Mtb感染的主要免疫細胞有巨噬細胞、樹突狀細胞（dendritic cell，DC）等〔3〕。DC 是連接先天免疫和適應性免疫的重要橋梁細胞，在啟動和調(diào)節(jié)免疫應答中發(fā)揮重要作用，參與清除Mtb。細胞凋亡是宿主抵抗病原體的重要防御機制，DC凋亡參與宿主的抗感染免疫，除了在感染早期限制Mtb的生長，在誘導獲得性細胞免疫應答時，一定條件下可導致細胞死亡，有助于殺死胞內(nèi)寄生Mtb〔4〕。了解在抗Mtb感染過程中DC的凋亡機制，對于控制Mtb的胞內(nèi)感染具有重要意義。本實驗建立了不同毒力Mtb與小鼠DC2.4混合培養(yǎng)模型，用流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）Annexin V-FITC∕PI 雙染法檢測Mtb標準株H37Ra和Mtb臨床分離株14-11感染DC2.4的凋亡情況，探討不同毒力Mtb感染誘導DC2.4的細胞凋亡率。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株Mtb臨床分離株14-11 由大理州疾病預防控制中心提供；Mtb標準株H37Ra 由大理大學基礎醫(yī)學院病原生物學綜合實驗室保存。

1.1.2 細胞株 小鼠DC2.4購自上海賽百慷生物技術股份有限公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 RPMI Medium-1640（美國Gibco公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，蘭州百靈生物技術有限公司）；中性結(jié)核羅氏培養(yǎng)基（珠海貝索生物技術有限公司）；雙抗（北京Solarbio公司）；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，自制）；Annexin V-FITC∕PI 細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；流式細胞分選儀（美國BD公司）。

1.2方法

1.2.1 小鼠DC2.4的培養(yǎng) 將DC2.4置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，待細胞貼壁后輕輕吸棄1∕2 培養(yǎng)基，補加1∕2 的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基后吹打均勻，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，每2～3 d 傳代1 次。培養(yǎng)至第9 天時，收集培養(yǎng)皿中所有的懸浮細胞，PBS 洗 滌1～2 次，用 適 量RPMI-1640 完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度至終濃度為3×106個∕mL。

1.2.2Mtb的培養(yǎng)及菌懸液制備Mtb復蘇傳代，接種于羅氏固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期時（約3～4 周）刮取生長良好的H37Ra 菌落、14-11 菌落，用含有0.05%吐溫-80 的無菌0.9%氯化鈉溶液研磨均勻后，再用標準麥氏比濁管調(diào)整菌液濃度為3×107CFU∕mL備用。

1.2.3Mtb感染小鼠DC2.4 混合培養(yǎng)模型制備 將小鼠DC2.4 細胞（3.0×106個∕mL）分別接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，移至37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h；按照感染比10：1 每孔加入上述處理好的菌懸液3.0×107CFU∕mL，每孔1 mL；37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱孵育，分別于混合培養(yǎng)1、3、6、12、24 h收集細胞進行檢測。

1.2.4 流式細胞術檢測DC2.4 凋亡率 按Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒操作說明書操作，分別于感染后1、3、6、12、24 h 收集細胞（用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化），1 000 r∕min 離心去上清液，PBS 洗滌2 次，各試驗組樣品加入100 μL Binding Buffer 重懸細胞，輕輕混勻；加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，再加入5 μL 碘化丙啶（PI）染色液，混勻，室溫避光孵育20 min；1 000 r∕min離心10 min，棄上清液，重復洗滌1次，加入400 μL PBS重懸細胞；染色完成后1 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測各組凋亡率。

1.2.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DC2.4形態(tài)觀察倒置顯微鏡下觀察DC2.4的形態(tài)和生長，于培養(yǎng)第3 天可見細胞體積增大，向四周伸展出毛刺樣突起，呈樹根狀或多形性。小鼠DC2.4 分別與H37Ra 及14-11 混合培養(yǎng)1 h后，即有細菌侵入；培養(yǎng)3、6、12、24 h 后，倒置顯微鏡下可見細胞呈多形性；培養(yǎng)12 h 后部分細菌侵入細胞內(nèi)，細胞內(nèi)呈顆粒狀，并出現(xiàn)細胞核碎裂等形態(tài)學改變。隨著混合培養(yǎng)時間延長，此現(xiàn)象更加明顯。見圖1。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)

2.2H37Ra、14-11與DC2.4混合培養(yǎng)凋亡率H37Ra 與14-11 均能誘導小 鼠DC2.4 凋 亡，H37Ra在感染DC2.4 1、3、6、12、24 h 后細胞凋亡率均高于14-11，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），在混合培養(yǎng)1、12 h后細胞凋亡率略高于其他時間點，細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。未感染Mtb的小鼠DC2.4 設為對照，對照在24 h 時細胞凋亡率較高，1、3、6、12 h 時的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。Mtb感染DC2.4 細胞凋亡率曲線見圖2。

2.3不同毒力Mtb感染小鼠DC2.4后流式細胞術檢測凋亡率采用Annexin V-FITC∕PI 標記法檢測不同時間段細胞凋亡情況。見圖3。使用經(jīng)凋亡誘導處理的細胞，作為對照進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊并設定十字門位置。左下象限（Anˉ，PIˉ）代表正常活細胞，右下象限（An+，PIˉ）代表早期凋亡細胞，左上象限（Anˉ，PI+）代表收集過程中的損傷細胞，右上象限（An+，PI+）代表壞死細胞和晚期凋亡細胞。右下象限（An+，PIˉ）與右上象限（An+，PI+）凋亡率之和為總凋亡率。

表1 H37Ra感染、14-11感染及對照不同時間凋亡率（±s，%）

表1 H37Ra感染、14-11感染及對照不同時間凋亡率（±s，%）

注：與對照相比*P＜0.05。

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圖2 不同毒力Mtb感染DC2.4不同時間凋亡率

圖3 流式細胞術檢測Mtb感染DC2.4凋亡率

3 討論

結(jié)核病仍然是世界范圍內(nèi)單一傳染性病原體死亡的主要原因，是全世界所面臨的難題，特別是在云南地區(qū)結(jié)核病發(fā)病率高，不同的Mtb菌株具有不同毒力及流行病學特征，為了進一步研究更好的保護策略需要確定Mtb的免疫反應機制。DC 是免疫應答中重要的免疫細胞，在遞呈Mtb抗原中起著重要作用，也是連接先天免疫和適應性免疫的重要細胞。DC 表達甘露糖受體和DC 特異性非整合素，它們能夠識別Mtb配體〔5〕。當Mtb入侵機體后，除調(diào)動免疫系統(tǒng)清除病原體外，宿主細胞還會通過細胞凋亡來抑制病原體的存活。細胞凋亡除了在感染早期限制Mtb的生長，在誘導獲得性細胞免疫應答中也起著重要作用，并在一定條件下導致細胞死亡〔6〕。細胞凋亡與壞死不同，是宿主抵抗病原體的重要防御機制，涉及多種成分和復雜的信號轉(zhuǎn)導途徑。細胞凋亡的激活機制包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑。外源性途徑通常由細胞外配體激活，啟動細胞表面死亡受體（如腫瘤壞死因子受體和Fas 受體），形成凋亡誘導信號復合物；內(nèi)源性途徑被細胞內(nèi)信號激活，依賴于膜間線粒體空間的蛋白質(zhì)釋放〔7〕。細胞內(nèi)Mtb已經(jīng)進化出多種有效的機制來調(diào)控宿主細胞凋亡，許多Mtb效應因子與凋亡途徑有關，已報道的抗凋亡Mtb抗原包括PtpA、NuoG、PknE、SecA2、SodA、SigH、MPT64 和Rv3354 等〔8〕。Mtb已知的促凋亡抗原包括LpqH（19kda 脂蛋白）、PE_PGRS33、ESAT-6、OppD、PstS1、Rv0183、Rv0901、PE9∕PE10 和Mce4A〔9〕。Mtb感 染 機 體 后，通 過ManLAM 激 活AKt∕蛋 白 激 酶B∕BCL-2 通路抑制細胞凋亡，促進細胞壞死，利于Mtb的擴散〔10〕。細胞凋亡的阻斷和壞死的誘導可能是Mtb逃避或延遲抗原遞呈的主要策略之一。凋亡細胞的吞噬作用，其中一個重要的因素是通過DC 交叉遞呈抗原，凋亡細胞將抗原呈遞給DC 以增強獲得性免疫，細胞凋亡控制了細菌的繁殖，降低了細菌在細胞中的生存能力〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb感染巨噬細胞后，通過DC 導致CD8+T淋巴細胞活化促使吞噬凋亡囊泡釋放〔12〕。Ramos-Martinez 等〔13〕研究表明，DC 的凋亡與Mtb的毒力有關，Mtb菌株的毒力強弱可導致人類DC 的不同免疫反應，毒性較低的Mtb菌株可以誘導DC和巨噬細胞凋亡，并以此方式成為其他抗原提呈細胞獲取和促進有效適應性免疫應答的方式。Lee 等〔14〕研究表明Mtb感染機體后主要導致細胞壞死，包括H37Ra 和BCG 減毒株在內(nèi)主要誘導細胞發(fā)生凋亡，從而控制結(jié)核感染及擴散；然而Mtb強毒株如H37Rv 可抑制細胞凋亡并誘導細胞壞死，引起結(jié)核擴散。Behar等〔15〕研究表明，毒力較弱的Mtb感染機體后，TLRs 激活絲裂原活化蛋白激酶，誘導腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等促炎因子的產(chǎn)生，P19 可能是弱毒株Mtb的凋亡誘導因子，可以通過TLR-2發(fā)出信號并激活caspase-8，從而導致細胞凋亡，然而這一機制依賴時間和劑量。Danelishvili 等〔16〕研究表明，強毒株Mtb分泌的一些蛋白質(zhì)，如NADH-1、Rv3654c 和Rv3655c 抑制巨噬細胞凋亡，它們通過調(diào)節(jié)一氧化氮和促炎細胞因子的產(chǎn)生來改變與TLRs 的關系。強毒株H37Rv 抑制凋亡還可能是由于誘導ESX-1 分泌EspJ 相關蛋白磷酸化，因此推測EspJ是Mtb的毒力因子〔17〕，H37Rv還可增加microRNA-132 的表達，從而阻止人單核細胞來源的DC中促炎細胞因子的分泌〔18〕。

已有研究顯示，細胞凋亡在機體免疫系統(tǒng)抵抗Mtb的免疫應答及免疫耐受中發(fā)揮重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)不同毒力的Mtb菌株作用于小鼠DC2.4可誘導產(chǎn)生不同的凋亡結(jié)果，毒力較強的Mtb可抑制DC凋亡，以逃避先天免疫和延遲適應性免疫的啟動；相比之下，毒力較弱的Mtb更易誘導DC 凋亡，減少細菌活力。細胞凋亡是Mtb采取的一種重要的免疫逃避策略，在凋亡過程中，Mtb與宿主細胞之間的相互作用可以被用來研究更好的預防結(jié)核病的措施。盡管目前對凋亡信號通路如何被廣泛用作Mtb效應器增強細胞內(nèi)生存和發(fā)病機制的靶點有所認識，但如不同的Mtb效應蛋白在體內(nèi)宿主防御Mtb感染過程中如何協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)細胞凋亡等重要問題仍有待解決。