短期異常酸、堿脅迫對中華絨螯蟹生理和生長的影響

張俊彪，崔廣同，蔡春芳，任勝杰，倪 沁，王承睿，李文健，葛逸揚，丁惠明，張 鋮

(1.蘇州大學基礎醫學與生物科學學院，江蘇省水產動物與營養重點實驗室，江蘇蘇州 215123；2.蘇州市陽澄湖國家現代農業示范區發展有限公司，江蘇蘇州 215123)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis，簡稱河蟹)是我國重要的淡水養殖品種，脫殼是其實現個體增長的必由途徑，也是影響其存活率的重要環節。養殖過程中為促進河蟹順利脫殼，蟹塘通常栽種大量水草供其藏身棲息。然而，在相對較小且封閉的池塘環境中，水草的光合作用和呼吸作用及微生物發酵常常導致水體pH劇烈變化。在養殖生產中發現，晴天時大多蟹塘pH高于9.4，pH最高的可達10.3以上，也有少量蟹塘因水草衰敗腐爛等原因使水體pH降至3.0以下。大量研究表明異常酸、堿環境會造成水生動物鰓組織損傷[1]，改變其能量代謝方式[2]，并可能影響其正常脫殼[3]和生長[4,5]。河蟹在酸、堿脅迫時也呈現相似的生理響應[2,6]，但尚無關于極端異常酸、堿脅迫對河蟹生理和生長影響的研究報道。

本實驗通過觀察短期極端酸、堿脅迫對河蟹血清生化、抗氧化力、組織損傷、后續脫殼增長率和存活率的影響，旨在揭示短期酸、堿脅迫的危害，繼而為優化養殖管理技術提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計

本研究包含兩個實驗。實驗一重點研究短期酸、堿脅迫對河蟹成蟹生理的影響，實驗二重點探究短期酸、堿脅迫對河蟹幼蟹脫殼增長率和存活率的影響。

1.2 短期酸、堿脅迫對河蟹成蟹生理的影響

1.2.1 飼養管理及樣品制備

實驗在蘇州市陽澄湖國家現代農業示范區發展有限公司研究生工作站進行。實驗蟹購自本地蟹苗養殖場，在室內水泥池中暫養15 d，期間投喂河蟹商品飼料。每天7∶30和18∶30各飽食投飼一次。暫養結束后禁食24 h，選取225只規格整齊、附肢齊全的河蟹，隨機分入9個體積為400 L的圓形塑料缸內飼養，缸內盛有pH分別為3.0(酸脅迫組)、7.5(對照組)和10.3(堿脅迫組)的水250 L，每缸放養25只，三個平行。實驗開始時蟹的體均重為(50.4±2.5) g。以PVC網片作為河蟹的攀爬物和隱蔽物。實驗期間每3 d吸污1次并換水1/3。養殖用水為經沉淀至少48 h的陽澄湖水。于投飼后0.5 h監測、并調整pH兩次。每天收集死蟹并稱重、記錄。實驗期間水溫20～24 ℃，24 h持續增氧，水體溶氧不低于6.7 mg/L。

1.2.2 血清生化分析

分別于脅迫前(0 h)和脅迫后6 h、12 h、1 d、3 d和5 d，及恢復2 d、6 d和15 d時采樣。采樣時，隨機從每缸取3只河蟹，用1 mL一次性注射器從第4步足基關節處抽取血淋巴并轉入1.5 mL EP管中，4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min收集血清。血清乳酸脫氫酶活性(LDH，U/L)及血糖濃度(GLU，mmol/L)、總蛋白濃度(TP，g/L)和尿素濃度(Urea，mmol/L)采用寧波美康生物科技股份有限公司生產的試劑盒檢測。血清總超氧化物歧化酶活性(T-SOD，U/mg prot)和總抗氧化力(T-AOC，U/mg prot)采用南京建城生物工程有限公司生產的試劑盒測定。血清生化指標均采用全自動生化分析儀(C8000，Abbott Laboratories，USA)測定。

1.2.3 鰓組織碳酸酐酶(CA)和Na+-K+-ATPase(NAK)活力測定

脅迫5 d時每缸隨機取3只河蟹，在冰盤上麻醉后解剖取鰓組織，用4 ℃預冷的PBS沖洗并液氮速凍保存。測定前于冰浴中充分勻漿后，5 000 r/min離心15 min，取上清，用上海優選生物科技有限公司生產的試劑盒測定。

1.2.4 肝胰腺和肌肉糖原含量測定

脅迫5 d和恢復15 d時從每缸分別隨機取3只河蟹，冰浴麻醉后解剖取肝胰腺和肌肉組織，用4 ℃預冷的PBS沖洗并液氮速凍，用30% NaOH沸水浴20 min充分水解，采用南京建城生物工程有限公司生產的試劑盒測定其糖原含量。

1.2.5 組織切片

脅迫5 d時從每缸隨機取3只河蟹，冰浴麻醉后解剖取肝胰腺和鰓組織，用4 ℃預冷的PBS沖洗后放入4%甲醛溶液固定24 h后，按常規石蠟組織切片制作程序進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度5 μm，經HE染色后分片。用顯微成像系統(AXoskop顯微鏡，Carl Zeiss，Oberkochen，Germany；彩色攝像機，VCKY-F30，Tokyo，Japan)觀察并采集組織切片照片。

1.3 短期酸、堿脅迫對河蟹幼蟹生長和脫殼的影響

實驗蟹[初重為(0.87±0.21)g]來源、馴化及飼養管理方式同前。選取450只規格整齊、附肢齊全的河蟹隨機分養于9個體積為400 L的圓形塑料缸內(盛水約150 L)，每缸放養50只。用1 mol/L HCl和NaOH分別將缸內的水于10 h內逐漸調至pH 3.0、pH 7.5和 pH 10.3，每個處理三個平行，隨機分配。脅迫5 d后于10 h內將酸、堿性的水逐漸換成pH 7.5的對照用水繼續飼養。每天收集死蟹及殘餌并稱重、記錄，收集脫下的頭胸甲并測定殼寬、殼長和脫殼日期。期間水溫為18～23 ℃。飼養4周后，禁食24 h，稱每缸蟹的總重并計數。成活率、平均增重率、脫殼增長率和脫殼周期的計算公式如下：

成活率=Nf/Ni×100%；

脫殼增長率=(La-Lb)/Lb×100%；

個體增重率=(Wf-Wi)/Wi×100%；

脫殼周期=第二次脫殼日期-第一次脫殼日期。

注：Ni為飼養開始時每缸放養的蟹只數；Nf為飼養結束時每缸存活的蟹只數；La為脫殼后頭胸甲寬(mm)；Lb為脫殼前頭胸甲寬(mm)；Wf為平均末重(g/crab)；Wi為平均初重(g/crab)。

1.4 數據處理

實驗數據以平均數±標準差表示。各處理間的差異采用單因子方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時再進行Duncan’s多重比較；兩個處理間進行比較時采用獨立樣本t-檢測，P<0.05為差異顯著。數據分析軟件為SPSS 22.0。

2 結果

2.1 酸、堿脅迫對河蟹生理的影響

由圖1可知，酸、堿脅迫后6 h和12 h血清LDH活力均顯著高于對照組，3 d時均顯著低于對照組，酸脅迫的變化幅度更大。脅迫5 d時各組間差異不顯著，但此時酸脅迫組河蟹全部死亡。恢復期堿脅迫組與對照組差異均不顯著。酸脅迫后GLU劇烈升高，于12 h到達峰值，此時GLU比對照組高約14倍，脅迫5 d時GLU也顯著高于對照組，其余時刻差異不顯著。堿脅迫6 h和12 h時GLU也高于對照組但差異不顯著，最高值為對照組的2.7倍，恢復期堿脅迫組與對照組差異不顯著。酸脅迫24 h血清尿素含量顯著低于對照組，其余時刻及堿脅迫組血清尿素含量和對照組無顯著差異。酸脅迫6 h和24 h血清TP顯著高于對照組，堿脅迫24 h血清TP也顯著高于對照組，恢復6 d時觀察到堿脅迫組顯著高于對照組，其余時刻差異不顯著。

圖1 酸、堿脅迫對河蟹LDH活力、GLU、Urea及TP濃度的影響Fig.1 Effects of acid and alkali exposure on serum activity of LDH，GLU，Urea and TP of E.sinensis同一時刻柱上小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)，n=3。圖2同。

由圖2可知，酸、堿脅迫12 h和24 h血清T-AOC活力顯著高于對照組。堿脅迫6 h 和5 d時血清T-AOC顯著高于對照組而酸脅迫組低于對照組。恢復期堿脅迫組與對照組差異不顯著。酸脅迫3 d時血清T-SOD顯著高于堿脅迫組，但酸、堿脅迫后T-SOD與對照組的差異均不顯著。

由表1可知，與對照組相比，酸、堿脅迫5 d肝糖原顯著下降，而肌糖原變化不顯著。恢復15 d后堿脅迫組肝糖原含量仍顯著低于對照組。酸脅迫5 d后鰓NAK酶活力顯著低于堿脅迫和對照組，堿脅迫和對照組間差異不顯著。各處理間CA差異不顯著。

圖2 酸、堿脅迫對河蟹血清T-AOC和T-SOD活力的影響Fig.2 Effects of acid and alkali exposure on serum T-AOC and T-SOD of E.sinensis

表1 酸、堿脅迫對河蟹肝胰腺和肌肉糖原含量及CA和NAK活力的影響Tab.1 Effects of acid and alkali exposure on glycogen content of hepatopancreas and muscle and enzyme activity of CA and NAK in gill of E.sinensis

由圖3可知，與對照組相比，酸、堿脅迫5 d時均使肝小管基底膜與上皮細胞發生脫離，且酸脅迫時脫離更嚴重。由圖4可知，與對照組相比，酸、堿脅迫5 d時均使鰓小片變形、斷裂。

2.2 酸、堿脅迫對河蟹后續生長及脫殼的影響

同對照組相比，酸、堿脅迫5 d均顯著降低了河蟹成活率，且酸脅迫組成活率顯著低于堿脅迫組(表2)。酸脅迫顯著縮短脫殼周期，降低脫殼增長率；相應地，脫殼次數增加，平均增重率顯著高于堿脅迫組和對照組。堿脅迫組脫殼增長率和脫殼周期低于對照組但差異不顯著。

圖3 河蟹酸、堿脅迫5 d后肝胰腺形態結構(H.E.)Fig.3 Hepatopancreas morphology of E.sinensis after acid and alkali exposure for 5 days(H.E.)A：pH 7.5(對照)，示基底膜緊貼肝小管，未見脫落；B：pH 3.0，基底膜與上皮分離；C：pH 10 .3，基底膜與上皮分離。BL：基底膜。

圖4 河蟹酸、堿脅迫5 d后鰓小片形態結構(H.E.)Fig.4 Gill lamellae morphology of E.sinensis after acid and alkali exposure for 5 days(H.E.)A：pH 7.5(對照組)，示正常鰓小片結構；B：pH 3.0(酸脅迫組)，示鰓小片結構變形；C：pH 10.3(堿脅迫組)，示鰓小片變形、腫脹；PC：柱狀細胞。

表2 5 d酸、堿脅迫對河蟹存活率和脫殼增長率的影響Tab.2 Effects on survival rate and moulting length increase rate of E.sinensis after acid and alkali exposure for 5 days

3 討論

酸、堿脅迫會導致機體產生過量的氧自由基[7]，為了清除自由基以消減氧化損傷，機體會提高T-AOC和T-SOD活力[8]。本研究結果表明，酸、堿脅迫后6 h和24 h血清T-AOC活力顯著升高(圖2)，提示此時機體具有對酸、堿脅迫的正常應答能力。然而，酸脅迫3 d和5 d時T-AOC低于對照組，這可能是由于嚴重的氧化應激導致代償功能的喪失[9]。從T-SOD來看，酸脅迫后6 h和12 h 時也有所升高，與T-AOC的結果一致。然而，堿脅迫后T-SOD活力低于對照組，盡管差異不顯著。存活率等其它指標表明，堿脅迫引起的應激反應要比酸脅迫弱，損傷小，因此，T-SOD下降不大可能是由于免疫疲勞或者代償功能喪失。在中國對蝦(Fenneropenaeuschinensis)上也觀察到堿脅迫后T-SOD下降[10]。甲殼動物應對氧化應激的機制可能與其它動物有所不同，其體內富含蝦青素，蝦青素是一種高效抗氧化劑[11]，堿脅迫可能促進河蟹調用蝦青素抗氧化[7]。在養殖生產中發現，pH 10.3和pH 3.0的池塘內河蟹體色均較淺甚至略顯紅色，可能與甲殼中結合態蝦青素釋放用于抗氧化有關。

動物在應激時往往有氧呼吸受到抑制，機體為了應對外界刺激，激活無氧呼吸通路關鍵酶，增強糖酵解產能[8,16]。本研究中血清生化分析結果表明，酸、堿脅迫6 h和12 h后均增加了血清LDH活力和GLU[17]含量(圖1)，其中酸脅迫12 h時血清GLU是對照組的14倍，同時，脅迫5 d時肝糖原含量顯著下降，這一結果與已有報道一致[8]。比較酸、堿脅迫后肝糖原和肌糖原的變化趨勢，發現肌糖原與對照組差異不顯著，而肝糖原在脅迫時顯著下降，表明急性脅迫時河蟹趨向于利用肝糖原而非肌糖原。

酸、堿脅迫增加了血清TP含量，尤其是酸脅迫時，但血清尿素含量未見顯著增加。這一現象與賈小燕[18]等在河蟹鹽度脅迫時觀察到的現象一致，提示應激反應時河蟹可能主要不是依靠分解蛋白供能[19]。TP升高可能主要是為了滿足滲透壓調節[20]和維持離子跨膜轉運[21]以適應異常環境。

蟹塘pH主要受水草盛衰的影響，多年調研中未見蟹塘pH持續處于極端狀態。盡管這種極端pH異常的持續時間較短，但研究中仍發現，pH連續5 d為10.3的蟹塘，后續脫殼期草叢中出現了不少脫殼不遂的死蟹，且活蟹體色及肝胰腺顏色普遍較淺。而在水體pH為3.0的苗種池塘中，蟹的體色和鰓均有發紅現象。由此推測，短期極端酸、堿脅迫可能會引起組織損傷，這種短期強脅迫很可能是養殖生產實踐中河蟹存活率低的重要原因。從組織形態看，酸、堿脅迫5 d后均出現鰓小片損傷變形(圖4B和4C)，肝胰腺基底層與上皮分離(圖3B和3C)，證明短期極端酸、堿脅迫均引起了河蟹鰓和肝胰腺組織損傷。從肝胰腺組織切片看，酸脅迫引起的組織損傷明顯強于堿脅迫(圖3B和3C)，與上述抗氧化力和血清生化分析結果相同，也與大多文獻報道結果一致[16,22]。

本研究結果表明，酸、堿脅迫會導致河蟹應激脫殼，使脫殼周期縮短，平均個體增重率短期內有所升高。這一現象與日本對蝦(Penaeusjaponicus)[23]和斑節對蝦(P.monodon)[24]相似。但處于脅迫環境下通常會有更多的能量被用于維持內環境穩定[25]，從而導致飼料利用效率低下，生長發育遲緩[22]。本研究結果也表明酸、堿脅迫均顯著降低了河蟹成活率和脫殼增長率。蟹塘內水草的有無及其狀態被認為是影響河蟹產量和規格的決定因素。本研究結果清楚地表明，短期極端酸、堿脅迫是影響河蟹存活率和脫殼增長率的重要原因。蟹塘中酸脅迫比較少見，但短期pH大于10的池塘比比皆是。為了提高存活率和脫殼增長率，從而提高產量，養殖過程中要注意對pH的管控。