血府逐瘀湯影響退變椎間盤髓核組織內蛋白水解酶和微血管生成的機制

郭義 林俊

(萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院骨科，江西 萍鄉(xiāng) 337000)

椎間盤退變增加了腰痛的風險，并在社會中造成嚴重的經濟和健康負擔〔1〕。成人椎間盤主要由三部分組成，包括內髓核，外環(huán)狀纖維和終板〔2〕。椎間盤是無血管的，這使得損傷后完全修復。椎間盤退變有很多原因，其中炎癥起著重要作用〔3〕。白細胞介素(IL)-1β具有有效的促炎作用，可刺激促炎因子的釋放〔4〕。已經證明它在椎間盤退變期間導致炎癥，基質降解，氧化應激反應和細胞凋亡〔5〕。因此，由于在椎間盤退變早期階段的炎癥作用，抗炎治療是優(yōu)先考慮的因素。據報道，血府逐瘀湯是治療椎間盤退變疾病的一種古老的中藥配方，由11種粗草藥組成：桃李、當歸、川芎、紅花、芍藥、地黃、枳殼、柴胡、桔梗、牛膝和甘草〔6〕。血府逐瘀湯衍生的化合物，包括羥基紅花黃色素A和苦杏仁苷，已被證明具有控制炎癥反應的能力〔7〕。血府逐瘀湯具有血管生成作用，不僅可以增加雞胚絨毛尿囊膜模型中的血管數量，還可以動員骨髓內皮祖細胞(EPC)，促進EPC分化和血管形成〔8，9〕。在炎癥相關的結腸癌發(fā)生受到血府逐瘀湯的抑制，表明它可以作為治療結腸炎相關結腸癌的強有力的預防劑〔10〕。另外，已經在兔關節(jié)軟骨細胞中證明了血府逐瘀湯抑制基質金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-13的表達〔11～13〕。血府逐瘀湯對IL-1β誘導的髓核的影響尚未進行過研究，因此，本研究旨在探討血府逐瘀湯影響退變椎間盤髓核組織內蛋白水解酶和微血管生成的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 體重200～250 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由實驗動物研究中心提供。將它們在標準條件下維持至少1 w，然后禁食12 h，在每次實驗前自由獲取食物和水。

1.2椎間盤退變模型 根據體重，用1%戊巴比妥鈉(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)以0.4 ml/kg麻醉SD大鼠。對于椎間盤退變模型，Co7/Co8或Co8/Co9尾椎椎間盤之間的椎間盤間隙首先通過放射線照相定位。將由手工制作的塞子控制的20號無菌針插入距離背側至腹側約5 mm處，旋轉360°并保持在固定位置30 s，然后移除。

1.3醫(yī)學倫理學問題 所有外科手術干預、治療和術后動物護理程序均嚴格按照機構動物護理和使用委員會的規(guī)定進行，并符合實驗動物護理和使用指南。

1.4實驗分組 將72只雄性大鼠分為對照組(無針刺或治療)；椎間盤退變組(僅針刺)；血府逐瘀湯組(每周注射含50 μmol/L血府逐瘀湯的PBS進行針刺)各24只。由于椎間盤的無血管性質，使用31-G針的微量注射器進行注射。這里使用的體內劑量是基于體外實驗，其中我們確定了血府逐瘀湯的無毒性和有效性。

1.5實驗方法

1.5.1大鼠髓核細胞的分離、培養(yǎng)和治療 將髓核細胞維持在DMEM/F12(Gibco公司，紐約)和補充有抗生素的10%磷酸鹽緩沖液(PBS)中。使用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)將細胞以80%～90%的傳導率傳代。在以下所有實驗中，我們對細胞使用了2～3次傳代。將細胞在37℃培養(yǎng)箱中于5%CO2下培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換一次。對于細胞活力檢測，使用不同濃度的血府逐瘀湯處理髓核細胞 24 h。為了檢測炎癥的指標，用血府逐瘀湯預處理細胞2 h，然后用或不用IL-1β處理24 h。

1.5.2血府逐瘀湯制劑 血府逐瘀湯由以下成分組成：當歸9 g、地黃9 g、桃李12 g、紅花9 g、枳殼6 g、芍藥6 g、柴胡3 g、甘草6 g、桔梗4.5 g、川芎4.5 g和牛膝9 g。原料購自醫(yī)院藥房。每種藥草均由大學中草藥系的草藥植物學家認證。根據標準方法，使用具有上述比例的11種血府逐瘀湯草藥生成血府逐瘀湯的凍干粉末。最后，確定1 g凍干粉末含有5.2 g粗草藥。根據1 g/ml(W/V)的標準，將其在用蒸餾水分解之前儲存在4℃下使用。

1.5.3總RNA分離和實時PCR 使用RNAiso試劑提取總RNA。使用2 μg RNA和PrimeScriptTMRT Master Mix進行逆轉錄。使用SYBR?檢測cDNA，在StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)(應用生物系統(tǒng)公司，美國)上的Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒。使用2-ΔΔCt方法分析數據。使用的引物序列為MMP-1，上游GCGTATATGGGCTAGAAGCAT、下游GCGTATATACGTTTTAGAGCC；MMP-3，上游TAGCTATGCGTAAATTTCGCT、下游AAATTGCGCGTAGCGCGGCA；MMP-9，上游CATTTAGCTAGAGCTTTGCCG、下游GCTAGATCGCTAGCTAGCTAG；β-actin，上游GTATAAATTCTATGCGCGATA、AAAACGCGCTAGC TCGCCGT。

1.5.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 在9體積(1∶9，W/V)冰冷的生理鹽水中裂解髓核細胞。將勻漿物離心15 min(3 000 r/min，4℃)。根據制造商的說明書(武漢華美生物工程有限公司，中國)，將上清液用于測量MMP-1、MMP-3和MMP-9的含量。使用Bradford方法測量組織蛋白質濃度。

1.5.5蛋白質免疫印跡 通過蛋白質免疫印跡檢測微血管生成相關因子〔血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和轉化生長因子(TGF-β)〕蛋白表達。在蛋白質裂解緩沖液(碧云天生物技術研究所，上海)中裂解髓核細胞。通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白質測定試劑盒(碧云天生物技術研究所，上海)測試蛋白質濃度，并將蛋白質樣品與5倍加載緩沖液混合。通過10%或12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質，并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(密理博公司，上海)。在5%脫脂牛奶中封閉2 h后，用TBST中的一抗在4℃下探測印跡過夜。將印跡與辣根過氧化物酶綴合的第二抗體(抗兔或抗小鼠；碧云天生物技術研究所，上海)一起溫育。然后使用增強的化學發(fā)光(密理博公司，上海)顯色印跡，并使用Bio-Rad XRS化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(伯樂生命醫(yī)學產品有限公司，上海)成像。使用Image J軟件定量條帶密度。相對于GAPDH的水平呈現蛋白質表達量。

1.5.6細胞活力測定 根據方案使用細胞計數試劑盒-8(CCK-8；東仁化學科技有限公司，上海)評估細胞活力。將大鼠髓核細胞以2 000個細胞/孔的密度接種在96孔板中。在血府逐瘀湯處理24 h后，除去每個孔中的培養(yǎng)基并用含有10% CCK-8溶液的200 μl新鮮培養(yǎng)基替換，并將細胞在37℃再培養(yǎng)2 h。收集100 μl樣品，并使用酶標儀(伯樂生命醫(yī)學產品有限公司，上海)在450 nm處在96孔板中測量活力。

1.5.7磁共振成像(MRI) 在大鼠尾椎針刺模型中在椎間盤之間每周注射一次血府逐瘀湯。在注射后通過MRI評估骶椎椎間盤。簡而言之，將大鼠麻醉并置于3.0T MRI掃描儀(Signa Excite，Little Chalfont公司，美國)中的俯臥位。T2加權切片在矢狀平面中成像。數據由3名獨立的盲法觀察員處理。

1.6統(tǒng)計分析 采用SPSS11.0軟件進行方差分析及LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1蛋白水解酶相關基因mRNA的表達水平 與對照組比較，椎間盤退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達水平明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達水平明顯降低(均P<0.05)。見表1。

表1 各組蛋白水解酶相關基因mRNA表達

2.2蛋白水解酶相關基因蛋白含量檢測 與對照組相比，椎間盤退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9含量明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤退變組MMP-1、MMP-3和MMP-9含量明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組蛋白水解酶相關基因蛋白含量

2.3Western印跡檢測微血管生成相關因子蛋白表達 與對照組相比，椎間盤退變組VEGF、FGF和TGF蛋白表達水平明顯降低，而血府逐瘀湯組較椎間盤退變組VEGF、FGF和TGF蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)。見表3、圖1。

2.4CCK-8檢測細胞活力 與對照組〔(98.23±8.72)%〕相比，椎間盤退變組細胞存活率〔(55.44±5.26)%〕明顯降低，而血府逐瘀湯組〔(82.74±7.95)%〕較椎間盤退變組細胞存活率明顯增加，3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=12.148，P=0.003)。

表3 各組微血管生成相關因子蛋白表達水平比較

圖1 Western印跡檢測微血管生成相關因子蛋白

2.5炎癥相關因子mRNA表達水平 與對照組相比，椎間盤退變組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達水平明顯增加，而血府逐瘀湯組較椎間盤退變組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組TNF-α、IL-6和IL-10 mRNA表達

2.6血府逐瘀湯減緩了大鼠尾椎椎體針刺模型中椎間盤退變的進展 MRI結果表明，與對照組相比，椎間盤退變組MRI信號強度降低。然而，與椎間盤退變組相比，血府逐瘀湯組顯示出更高的MRI信號強度。見圖2。

圖2 各組MRI評估骶椎椎間盤

3 討 論

椎間盤退變是一種流行的疾病，在衰老過程中自然發(fā)生。其特征在于局部髓核區(qū)域中細胞外基質的逐漸喪失，是成人背部疼痛的最常見原因，具有巨大的社會經濟意義〔14，15〕。金屬蛋白酶和促炎細胞因子在該過程中起重要作用〔16〕。因此，抗炎策略是椎間盤退變治療的重要組成部分。血府逐瘀湯因其有效的抗炎作用而廣為人知〔17〕。IL-1β被認為是一種重要的細胞因子，它通過刺激一系列不同介質(如趨化因子，細胞因子和MMPs)的產生而發(fā)揮有效的促炎作用〔18，19〕。已經充分描述了IL-1β在由退行性椎間盤影響的細胞中升高，這種作用與椎間盤體內平衡的功能失調密切相關并導致髓核組織的降解〔20〕。因此，本實驗中使用IL-1β作為促炎劑。

本研究結果表明，血府逐瘀湯抑制IL-1β誘導的炎癥介質(TNF-α、IL-6和IL-10)和基質降解蛋白酶(MMP-1，MMP-3和MMP-9)。此外，本研究發(fā)現血府逐瘀湯通過調節(jié)VEGF、FGF和TGF蛋白表達，增加微血管生成。體內MRI和組織學結果還顯示，血府逐瘀湯保護髓核免受椎間盤退變的進展。因此，血府逐瘀湯可能是治療椎間盤退變的潛在藥物。

除了體外研究，本研究使用大鼠尾椎針刺模型來評估血府逐瘀湯是否可以在體內保護髓核。證據表明，在椎間盤退變的發(fā)展中，炎癥加劇了軟骨的退化。本研究結果表明血府逐瘀湯治療可以減緩椎間盤退變的進展。