308nm單頻準(zhǔn)分子光對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞活力及細(xì)胞因子分泌水平的影響＊

田蔚蔚 ，劉排 ，李光 ，朱永軍 ，李娟

（1.江西省皮膚病專科醫(yī)院，南昌 330001；2.廣東省深圳怡禾星門診部，深圳 518000）

白癜風(fēng)是一種由于表皮和附屬器部位黑素細(xì)胞(melanocyte，MC)特發(fā)性損害而致色素脫失的常見的獲得性皮膚病。目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，且目前仍無(wú)令人滿意的治療方法。近年來國(guó)內(nèi)外已有較多的臨床研究證實(shí)308nm單頻準(zhǔn)分子光和308nm準(zhǔn)分子激光對(duì)白癜風(fēng)的治療有效[1-4]。但其作用機(jī)制方面的研究較少，目前有研究顯示308nm準(zhǔn)分子激光治療可能通過誘導(dǎo)皮損處T淋巴細(xì)胞凋亡[5]，降低CD4+和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞及皮損處 TGF-β（transforming growth factorβ，TGF-β）和 IL-10 的分泌[6]，影響角質(zhì)形成細(xì)胞的活力及不同細(xì)胞因子的分泌水平等[7-9]刺激殘存的黑素細(xì)胞聚集于外周毛囊外根鞘[10]；通過Wnt/β-Catenin信號(hào)通路刺激B16細(xì)胞的黑素生成[11]等發(fā)揮治療作用。而對(duì)于目前應(yīng)用更廣、更適用于基層使用的308nm單頻準(zhǔn)分子光的機(jī)制研究尚不明確[12]。

本研究通過研究308nm單頻準(zhǔn)分子光照射后人角質(zhì)形成細(xì)胞活力及其與黑素細(xì)胞形態(tài)功能調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子如干細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （stem cell factor，SCF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的分泌水平，來探討308 nm單頻準(zhǔn)分子光對(duì)白癜風(fēng)的可能治療機(jī)制，并通過比較不同照射劑量、不同照射時(shí)間組的比較探索劑量、照射時(shí)間對(duì)療效的可能影響，為308nm單頻準(zhǔn)分子光應(yīng)用于白癜風(fēng)臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 308nm單頻準(zhǔn)分子光治療儀（美國(guó)威峰）、酶標(biāo)儀（RT-6100，Rayto）、DMEM高糖培養(yǎng)基 （杭州四季青生物工程有限公司）、DMSO（Amresco公司）、0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）（凱基生物有限公司）、青霉素鏈霉素混合液（索萊寶科技有限公司）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）（BI生物有限公司）、24 孔培養(yǎng)板、96 孔培養(yǎng)板 （Corning公司）、Human bFGF ELISA檢測(cè)試劑盒 （上海酶聯(lián)）、Human GM-CSF ELISA檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)）、Human SCF ELISA檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)）。

1.2 人角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)及分組 采用HaCaT人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株 （南京凱基生物科技有限公司），加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 將HaCaT細(xì)胞按5×103/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中培養(yǎng)24h，給予不同劑量（100 mJ/cm2、200 mJ/cm2、300 mJ/cm2、400 mJ/cm2、500 mJ/cm2、600 mJ/cm2） 的 308nm 單頻準(zhǔn)分子光單次照射，對(duì)照組不予照射。經(jīng)照射后的細(xì)胞培養(yǎng) 24h后，每孔加入 50μL1×MTT，在 37℃孵育4h，吸出上清液，每孔加入 150μL DMSO，用平板搖床搖勻，用酶標(biāo)儀在550nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的A值。

1.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平 將HaCaT細(xì)胞按105/孔的細(xì)胞密度接種于24孔板中后，給予不同劑量（100mJ/cm2、200mJ/cm2、300mJ/cm2、400 mJ/cm2、500mJ/cm2、600mJ/cm2）的 308nm 單頻準(zhǔn)分子光單次照射，對(duì)照組不予照射，其后分別于6h、12h、24h、48h收集上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，450nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞因子 （SCF、bFGF、GM-CSF）濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件的進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，細(xì)胞活力A值采用t檢驗(yàn)，其余計(jì)量資料采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 308nm單頻準(zhǔn)分子光對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞活力的影響 308nm單頻準(zhǔn)分子光不同照射劑量組與對(duì)照組的 A 值比較發(fā)現(xiàn)，100、200、300、400、500mJ/cm2五個(gè)照射劑量組的各組A值與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異 （P＝0.429、0.682、0.823、0.538、0.671），而600 mJ/cm2照射劑量組的A值與對(duì)照組比較有顯著性差異（F＝4.281，P＝0.015）。 （圖 1）

圖1 不同劑量308nm單頻準(zhǔn)分子光照射后的HaCat細(xì)胞活力曲線

2.2 308nm單頻準(zhǔn)分子光對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞活力及其細(xì)胞因子分泌水平的影響 308nm單頻準(zhǔn)分子光照射后可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌SCF，不同照射劑 量 組 （0、100、200、300、400、500、600mJ/cm2） 的SCF 濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝12.992，P＝0.000），圖 2提示在0-500 mJ/cm2范圍內(nèi)，隨照射劑量的增多，分泌水平逐漸升高，但600mJ/cm2組分泌水平稍下降，其中 500mJ/cm2組明顯較 100mJ/cm2（P＝0.004）、200mJ/cm2（P＝0.017）組刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的SCF 濃度更高。不同照射時(shí)間組（6h、12h、24h、48h）的 SCF 濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （F＝5.502，P＝0.002），其中照射 24h、48h后的 SCF濃度較 6h更高 （P＝0.003、0.022）。

308nm單頻準(zhǔn)分子光照射后可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌 bFGF， 不同照射劑量組（0、100、200、300、400、500、600mJ/cm2） 的 bFGF 濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝46.967，P＝0.000），圖 3 提示在 0-400 mJ/cm2范圍內(nèi)，隨照射劑量的增多，分泌水平逐漸升高，但500mJ/cm2、600mJ/cm2組分泌水平稍下降，其中 400mJ/cm2組明顯較其他組（0、100、200、300、500、600mJ/cm2）刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的SCF濃度 更 高 （P ＝0.000、0.000、0.000、0.004、0.004、0.000）。 不同照射時(shí)間組（6h、12h、24h、48h）的 SCF濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝3.892，P＝0.012），其中照射12h 后的 bFGF 濃度較 6h、48h 更高 （P＝0.002、0.040）。

圖3 不同劑量308nm單頻準(zhǔn)分子光照射后的HaCat細(xì)胞分泌bFGF濃度變化

308nm單頻準(zhǔn)分子光照射后可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌GM-CSF，各照射劑量組的GM-CSF濃度高于非照光組（P＜0.05），但不同照射劑量組的組間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F＝8.615，P＝0.212）， 圖 4提示500mJ/cm2組分泌水平稍高于其它照射劑量組（100、200、300、500、600mJ/cm2），但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.079、0.591、0.887、0.105、0.481）。 不同照射時(shí)間組（6h、12h、24h、48h）的 SCF 濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F＝3.920，P＝0.012），照射 12h 濃度達(dá)到高峰值，高于 24h照射組（P＝0.037），但與其它時(shí)間點(diǎn)（6h、48h）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.995、0.574），但照射24h 后的 GM-CSF 濃度較 6h、12h 低 （P＝0.044、0.037）。

3 討論

圖4 不同劑量308nm單頻準(zhǔn)分子光照射后的HaCat細(xì)胞分泌GM-CSF濃度變化

目前白癜風(fēng)尚缺乏療效滿意的治療方案。而自從2003年Leone G等首次報(bào)道了308nm準(zhǔn)分子激光在37例白癜風(fēng)患者中的有效應(yīng)用后[13]，其后多項(xiàng)研究亦證實(shí)308nm準(zhǔn)分子激光及單頻準(zhǔn)分子光在白癜風(fēng)治療中的有效性[1-4]，且其較其他光療方法（PUVA、NB-UVB）更為有效，著色更快，累積劑量更小，且不良反應(yīng)如對(duì)周圍正常皮膚的刺激性、致癌性等均較小[4]。同時(shí)其亦可有效應(yīng)用于其它色素異常性疾病，均從側(cè)面驗(yàn)證其促進(jìn)黑素生成的作用[14]。目前308nm準(zhǔn)分子激光及單頻準(zhǔn)分子光已納入白癜風(fēng)的一線治療方案中。

308nm單頻準(zhǔn)分子光及308nm準(zhǔn)分子激光雖波長(zhǎng)相同，但是兩者所用機(jī)器不同，輻射特性、發(fā)光方式亦有差異。Duff等一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)顯示，兩者在白癜風(fēng)治療中的療效類似[15]，且308nm準(zhǔn)分子激光的費(fèi)用較308nm單頻準(zhǔn)分子光約貴十倍，因此后者較前者應(yīng)用性更為廣泛，尤其適用于基層醫(yī)院。目前308nm單頻準(zhǔn)分子光的機(jī)制研究尚欠缺。張勇等發(fā)現(xiàn)308nm單頻準(zhǔn)分子光可以使角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的SCF轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平表達(dá)均增加，其可能通過促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞SCF的表達(dá)而對(duì)白癜風(fēng)起到治療作用[12]。

本研究提示308nm單頻準(zhǔn)分子光照射劑量在100-500mJ/cm2之間時(shí)并未影響角質(zhì)形成細(xì)胞的活力，但600mJ/cm2的照射劑量下，角質(zhì)形成細(xì)胞活力稍下降，該研究結(jié)果與其它研究中的308nm單頻準(zhǔn)分子光及308nm準(zhǔn)分子激光類似[8，12]，而與NB-UVB的研究相比較，其影響角質(zhì)形成細(xì)胞活力的照射劑量更高，可能由于308nm單頻準(zhǔn)分子光和308nm準(zhǔn)分子激光較其他光療方法如NBUVB光譜更窄，也可能解釋了308nm單頻準(zhǔn)分子光及308nm準(zhǔn)分子激光較其它光療方法如NBUVB副作用如紅斑效應(yīng)、致癌性更小。

本研究測(cè)定細(xì)胞因子的分泌水平結(jié)果提示308nm單頻準(zhǔn)分子光可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌SCF、bFGF、GM-CSF三種細(xì)胞因子，SCF參與正常黑素細(xì)胞功能的表達(dá)，可與表達(dá)于黑素細(xì)胞上的配體KIT結(jié)合，活化酪氨酸激酶通道，對(duì)黑素細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和黑素的合成發(fā)揮著重要作用[7，9，12]。GM-CSF 在 UVA 誘導(dǎo)的色素沉著中作為黑素細(xì)胞的一種內(nèi)在刺激物，能誘導(dǎo)受UVB照射的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化[9，16]；bFGF則是MC的自然促分裂因子和天然絲裂原，可激活蛋白激酶2，促進(jìn)MC進(jìn)入S期，誘導(dǎo)MC的增殖分化和黑素的合成[8，9]。

不同照射劑量組的對(duì)比結(jié)果提示400-500mJ/cm2范圍內(nèi)SCF、bFGF的分泌水平隨著照射劑量的增加而增多，該檢查結(jié)果與既往308nm準(zhǔn)分子激光的研究結(jié)果部分相符[7-9，12]，其與臨床上觀察到的治療效果隨照射劑量的增加而增強(qiáng)的情況相符，600mJ/cm2組分泌水平開始下降，不排除與細(xì)胞活力下降有關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)為體外細(xì)胞研究，細(xì)胞活力受損后其余細(xì)胞增殖代償情況體外與體內(nèi)有異，因此在臨床上患者出現(xiàn)副作用如水皰形成時(shí)的治療劑量與體外實(shí)驗(yàn)觀察到的細(xì)胞活力受損的照射劑量并不相符，但可以推測(cè)在細(xì)胞活力嚴(yán)重受損（患者出現(xiàn)明顯副作用）之前，為提高治療效果，可逐漸提高照射劑量。而各照射劑量組之間的GM-CSF的分泌水平比較結(jié)果提示，雖500mJ/cm2組稍高于其他劑量組，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)合既往308nm準(zhǔn)分子激光的研究結(jié)果，在今后關(guān)于治療機(jī)制的進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)研究中更推薦使用SCF、bFGF兩種因子而非GM-CSF。

而不同照射時(shí)間組的對(duì)比研究提示在照射后的12-24h細(xì)胞因子分泌水平達(dá)高峰期，其后漸下降，因此在臨床治療過程中推薦治療間隔時(shí)間為2-3d，其治療效果明顯優(yōu)于一周一次的治療間隔[3，4]。

因本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)細(xì)胞上清液中的分泌型細(xì)胞因子水平，僅提示角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)308nm單頻準(zhǔn)分子光照射后，釋放分泌型細(xì)胞因子的能力，而對(duì)于細(xì)胞型細(xì)胞因子的水平、細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平等方面的探索尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。