基于CaCC的TRPV4調(diào)節(jié)劑高通量篩選細(xì)胞模型的建立

肖云萍，解宇浩，張嘉琪，洪啟元，郝峰*，王國慶

1吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院，吉林省吉林市 132013；2北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省吉林市 132013；3吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林省吉林市 132013

瞬時受體電位離子通道(transient receptor potential，TRP)是一種在生物體內(nèi)分布廣泛的非電壓依賴的非選擇性陽離子通道。TR P家族分為7個亞族：TRPA、TRPC、TRPM、TRPML、TRPN、TRPP及TRPV[1]。瞬時受體電位香草酸亞型4(transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4)是TRPV亞家族的成員，廣泛分布于心臟、大腦、腎臟、肺臟、肝臟、骨組織及皮膚等[2]，參與許多生理、病理過程，可能是多種疾病的潛在治療靶點(diǎn)。TRPV4調(diào)節(jié)劑在許多生理和病理過程中起著重要作用，如TRPV4激活劑可以減少動脈粥樣硬化斑塊的形成，促進(jìn)成年海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，以及促進(jìn)血管和動脈的生成[3-5]；TRPV4拮抗劑可治療水腫、疼痛、胃腸道疾病和肺部疾病，如咳嗽、支氣管收縮、肺動脈高壓和急性肺損傷等[6]。然而，大多數(shù)TRPV4的激活劑和抑制劑存在選擇性不強(qiáng)、效力不佳等問題。因此，篩選TRPV4特異性調(diào)節(jié)劑具有重要意義。TRPV4對Ca2+具有選擇通透性，其激活會引起Ca2+內(nèi)流，從而增加細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度[7]。鈣激活氯離子通道蛋白1(anoctamin 1， ANO1)是鈣激活氯離子通道(calcium-activated chloride channels，CaCC)的分子基礎(chǔ)之一，在細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高的作用下開放并向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)Cl-、I-等陰離子[7]。YFP-H148Q/I152L是遇I-會發(fā)生熒光淬滅的黃色熒光蛋白雙突變體[8]。因此，本研究利用穩(wěn)定共轉(zhuǎn)染ANO1和YFP-H148Q/I152L的Fischer大鼠甲狀腺濾泡上皮(Fischer rat thyroid，F(xiàn)RT)細(xì)胞系構(gòu)建基于CaCC靶向TRPV4的細(xì)胞篩選模型。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器 FRT細(xì)胞為本實驗室保存；ANO1真核表達(dá)載體和YFP-H148Q/I152L真核表達(dá)載體由本實驗室前期構(gòu)建[9-10]。Lipofectamine 3000脂質(zhì)體、Zeocin抗生素、G418抗生素、TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；兔抗大鼠TRPV4多克隆抗體、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體、山羊抗兔IgG(英國Abcam公司)；RT-PCR試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；ECL檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；F-12基本培養(yǎng)基、Eact、NFA、GSK1016790A、4α-PDD、 RN-1747、GSK2193874、HC-067047、RN-1734、Fura-2/AM(美國Sigma公司)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司)；PCR引物、切膠回收試劑盒(生工生物工程股份有限公司)。倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；PCR儀(美國ABI公司)；FLUOstar多功能酶標(biāo)儀(德國BMG公司)；CO2培養(yǎng)箱(日本Panasonic公司)；凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；Nanodrop 2000微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 RT-PCR檢測FRT細(xì)胞中TRPV4 mRNA的表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的FRT細(xì)胞株，按照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，應(yīng)用Nanodrop 2000檢測總RNA的濃度，測定RNA溶液A260/A280的比值范圍。對提取的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測總RNA的完整性。

本研究設(shè)計合成了8對特異性引物：TRPV1～ TRPV6和β-actin，其中TRPV4設(shè)計了2對引物：TRPV4-1和TRPV4-2。TRPV4-1、TRPV4-2及管家基因β-actin的引物序列如表1所示。按照2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀曝光成像。將目的條帶切下，采用切膠回收試劑盒對目的條帶進(jìn)行切膠回收，回收后的DNA溶液進(jìn)行核酸測序。

1.3 Western blotting檢測FRT細(xì)胞中TRPV4蛋白的表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的FRT細(xì)胞，經(jīng)RIPA裂解液裂解，提取總蛋白。采用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉后分別孵育兔抗大鼠TRPV4多克隆抗體(1:2000)、兔抗大鼠β-actin單克隆抗體(作為內(nèi)參)，4 ℃下孵育過夜。次日，PBST洗膜，室溫孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:500)2h，PBST洗膜，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室顯影技術(shù)采集化學(xué)發(fā)光圖像。

表1 TRPV4-1、TRPV4-2及β-actin引物序列Tab.1 Primer sequence of TRPV4-1, TRPV4-2 and β-actin

1.4 構(gòu)建共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞模型

1.4.1 最適抗生素濃度的選擇 取生長狀態(tài)良好的FRT細(xì)胞，分別加入濃度為1500、1000、800、600、400、200、100 μg/ml的Zeocin抗生素，培養(yǎng)2周后細(xì)胞全部死亡的最低濃度為Zeocin抗生素篩選的最適濃度。同理篩選G418抗生素的最適濃度。

1.4.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建共表達(dá)ANO1和YFPH148Q/I152L的細(xì)胞株 取生長狀態(tài)良好的FRT細(xì)胞，按照Lipofectamine 3000說明書步驟將ANO1轉(zhuǎn)染到FRT細(xì)胞中，2 d后于倒置熒光顯微鏡下觀察。利用最適濃度的Zeocin抗生素進(jìn)行篩選，3周后挑取倒置熒光顯微鏡下可見細(xì)胞膜上表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋。經(jīng)過多次有限稀釋得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ANO1的單克隆細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得表達(dá)ANO1的FRT細(xì)胞株。同理，將YFP-H148Q/I152L轉(zhuǎn)染到已穩(wěn)定表達(dá)ANO1的FRT細(xì)胞中，應(yīng)用最適濃度的G418抗生素進(jìn)行篩選，挑取倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞膜上和細(xì)胞質(zhì)中均可見綠色熒光的單細(xì)胞克隆團(tuán)，擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞株。

1.5 熒光淬滅動力學(xué)實驗驗證FRT細(xì)胞模型的有效性及功能

1.5.1 有效性驗證 取生長狀態(tài)良好的共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞，分為實驗組和對照組，每組3個復(fù)孔。實驗組加入120 μl含有ANO1特異性激活劑Eact(10 μmol/L)及高濃度碘離子的PBS溶液，對照組加入鈣激活氯離子通道抑制劑NFA(300 μmol/L)孵育10 min，再加入120 μl含高濃度碘離子的PBS溶液，采用FLUOstar多功能酶標(biāo)儀(發(fā)射波長540 nm，激發(fā)波長500 nm)檢測相對熒光強(qiáng)度(RFU)的動態(tài)變化。以5個點(diǎn)/s的速度動態(tài)檢測RFU，其中前2 s為基線，2 s后以200 μl/s的速度向?qū)嶒灲M孔中加入120 μl含有Eact及高濃度碘離子的PBS溶液，向?qū)φ战M孔中加入120 μl含高濃度碘離子的PBS溶液。

1.5.2 功能驗證 將生長狀態(tài)良好的共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞分為4組，每組3個復(fù)孔。其中3組加入含TRPV4激活劑GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747及高濃度碘離子的PBS溶液，另外1組加入含TRPV4抑制劑HC-067047孵育10 min，再加入含高濃度碘離子的PBS溶液，采用FLUOstar多功能酶標(biāo)儀檢測RFU的動態(tài)變化，利用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行宏計算，得到斜率(Slope)值。

將生長狀態(tài)良好的共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞分為6組，采用倍比稀釋法獲得不同濃度的激活劑和抑制劑。其中3組分別加入不同濃度的TRPV4激活劑GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747，采用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，加入含高濃度碘離子的PBS溶液，記錄RFU的動態(tài)變化，計算Slope值。另外3組加入不同濃度的TRPV4抑制劑GSK2193874、HC-067047、RN-1734孵育10 min，采用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，加入含有GSK1016790A及高濃度碘離子的PBS溶液，記錄RFU的動態(tài)變化，計算Slope值。

1.6 Fura-2熒光探針法檢測FRT細(xì)胞模型中Ca2+的濃度 將穩(wěn)定共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入Fura-2/AM，終濃度為5 μmol/L，37 ℃下孵育30 min。洗滌細(xì)胞，離心后制成細(xì)胞懸液。采用FLUOstar多功能酶標(biāo)儀(激發(fā)波長為340 nm和380 nm，發(fā)射波長510 nm)檢測，記錄靜息時和加入不同濃度GSK1016790A后340 nm/380 nm的熒光比值。加入Triton X-100及EGTA，測定最大熒光比值和最小熒光比值，計算Ca2+濃度。

1.7 FRT細(xì)胞模型的Z'因子評估 Z'因子是評估高通量篩選的一種重要指標(biāo)，計算公式如下：Z'=1－3×(|SDpositive|+|SDnegtive|)/(|Meanpositive|－|Meannegative|)[11]。將96孔板中的6列加入10 μmol/L GSK1016790A作為陽性對照(positive)，另外6列加入PBS溶液作為陰性對照(negative)，檢測96孔板的Z'因子值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.0軟件對激活劑和抑制劑的劑量依賴關(guān)系進(jìn)行非線性曲線擬合分析，繪制模型對不同激活劑和抑制劑的濃度依賴曲線，并計算半數(shù)有效濃度(EC50)、半數(shù)抑制濃度(IC50)，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析和Mann-Whitney檢驗，所有實驗均重復(fù)3次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FRT細(xì)胞中TRPV4 mRNA的表達(dá)情況 FRT細(xì)胞總RNA濃度為413.2 ng/μl，總RNA溶液的A260/A280為1.83。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，總RNA完整性良好，可用于進(jìn)一步cDNA的合成(圖1A)。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，TRPV4-1、TRPV4-2和β-actin分別在395 bp、455 bp和260 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的目的產(chǎn)物大小一致(圖1B)。TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV5、TRPV6特異性引物均未擴(kuò)增出 條帶。

將TRPV4條帶的切膠回收產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果在Chromas軟件上進(jìn)行分析，峰圖結(jié)果如圖1C所示，無重疊峰，其中豎線位置為內(nèi)含子。所測核苷酸序列采用美國生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology informatio，NCBI)的序列比對工具(basic local alignment search tool，BLAST)進(jìn)行比對，結(jié)果顯示其與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的TRPV4基因序列相似性為100%，表明所克隆的DNA片段即為目的基因片段，F(xiàn)RT細(xì)胞在mRNA水平上內(nèi)源性表達(dá)TRPV4 (圖1D)。

圖1 FRT細(xì)胞中TRPV4 mRNA的表達(dá)情況Fig.1 Expression of TRPV4 mRNA in FRT cells

2.2 FRT細(xì)胞中TRPV4蛋白的表達(dá)情況 Western blotting檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)RT細(xì)胞中有相對分子量為98 kD的TRPV4蛋白的表達(dá)(圖2)，表明FRT細(xì)胞在蛋白水平上內(nèi)源性表達(dá)TRPV4蛋白。

2.3 共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞模型構(gòu)建原理及結(jié)果 當(dāng)TRPV4通道被激活時，Ca2+內(nèi)流增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而引起CaCC的開放，細(xì)胞外I-被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，使黃色熒光蛋白YFP-H148Q/I152L發(fā)生熒光淬滅，測定原理如圖3所示。

圖2 FRT細(xì)胞中TRPV4蛋白的表達(dá)情況(Western blotting)Fig. 2 Expression of TRPV4 protein in FRT cells (Western blotting)

Zeocin、G418抗生素篩選的最適濃度均為1000 μg/ml。倒置熒光顯微鏡下清晰可見，F(xiàn)RT細(xì)胞膜上呈綠色熒光，表明ANO1表達(dá)在細(xì)胞膜上(圖4A)；FRT細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞膜上均可見綠色熒光，表明YFP-H148Q/I152L表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中(圖4B)。即成功構(gòu)建了穩(wěn)定共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞株。

圖3 基于CaCC靶向TRPV4的細(xì)胞篩選模型構(gòu)建原理Fig. 3 Construction principle of the screening cell model targeting TRPV4 based on CaCC

圖4 共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L細(xì)胞模型的構(gòu)建結(jié)果(×40)Fig.4 Construction of ANO1 and YFP-H148Q/I152L co-expression cell model (×40)

酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示，實驗組R F U明顯下降，表明ANO1開放，I-內(nèi)流，黃色熒光蛋白發(fā)生淬滅；對照組RFU無明顯變化，表明NFA抑制了ANO1的開放，如圖4C所示。該結(jié)果表明細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

2.4 共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞模型的功能驗證 加入TRPV4激活劑GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747后，熒光迅速淬滅。而加入TRPV4抑制劑HC-067047后，熒光未淬滅(圖5A)。加入激活劑組熒光Slope值明顯高于加入抑制劑組，各激活劑組與抑制劑組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，圖5B)，表明模型具有篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的功能。

在加入不同濃度的TRP V4激活劑和抑制劑后，熒光信號呈現(xiàn)不同的變化。激活劑和抑制劑的濃度與熒光Slope值呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行非線性曲線擬合分析，濃度取對數(shù)作圖，得到濃度效應(yīng)曲線：GSK1016790A、4α-PDD、RN-1747的EC50分別為9.17、50.06、147.50 μmol/L(圖6A)，GSK2193874、HC-067047、RN-1734的IC50分別為5.74、10.91、72.49 μmol/L(圖6B)。該結(jié)果表明激活劑和抑制劑對TRPV4通道的作用具有濃度依賴性，證實了該模型可用于TRPV4調(diào)節(jié)劑的篩選。

圖5 FRT細(xì)胞模型篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的功能鑒定(n=3)Fig.5 Functional identification of FRT cell model screening TRPV4 modulator (n=3)

2.5 共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞中Ca2+濃度的變化情況 加入不同濃度的GSK1016790A后，GSK1016790A濃度越高，RFU下降的幅度越大，熒光Slope值越大，如圖7A所示，熒光Slope值與GSK1016790A濃度呈劑量依賴關(guān)系。同時細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度瞬時升高，隨著GSK1016790A濃度的升高，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度隨之升高，Ca2+濃度與GSK1016790A濃度呈劑量依賴關(guān)系(7B)；熒光Slope值隨著細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度增加而增大，Ca2+濃度越大，熒光Slope值越大，如圖7C所示，F(xiàn)RT細(xì)胞模型熒光淬滅Slope值與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度呈正相關(guān)。

2.6 共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞模型的Z'因子評估 結(jié)果顯示，SDpositive值為5.06，SDnegtive值為1.57，Meanpositive值為78.2，Meannegative值為5.07，根據(jù)公式計算得到Z'因子為0.728(圖8)。一般認(rèn)為當(dāng)Z'因子＞0.5時，該高通量方法比較理想，因此建立的細(xì)胞模型適用于TRPV4調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。

圖6 TRPV4激活劑及抑制劑的劑量依賴曲線(n=3)Fig.6 Dose-dependent curves of TRPV4 activators and inhibitors (n=3)

圖7 熒光Slope值與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的關(guān)系(n=3)Fig.7 Relationship between fluorescence slope value and intracellular Ca2+ concentration (n=3)

3 討 論

圖8 共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞模型的Z'因子評估(n=48)Fig.8 Assessment of Z' factor in FRT cell model that coexpression of ANO1 and YFP-H148Q/I152L (n=48)

近年來，隨著藥物研發(fā)技術(shù)的迅速發(fā)展，離子通道作為重要的藥物靶點(diǎn)而備受關(guān)注[12-13]。 TRPV4作為離子通道之一，廣泛分布在消化、神經(jīng)、呼吸和心腦血管等系統(tǒng)[2]，可被溫度、機(jī)械刺激、滲透壓等因素激活，引起Ca2+的流動，通過對Ca2+和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等，進(jìn)而在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[14]。研究表明，TRPV4調(diào)節(jié)劑與動脈粥樣硬化、纖維化、疼痛、炎癥、腫瘤等密切相關(guān)[3,6,15-17]。但目前已發(fā)現(xiàn)的TRPV4調(diào)節(jié)劑均存在選擇性不佳等問題，且尚無高通量篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的方法，因此研究篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的方法具有重要意義。

目前，篩選離子通道調(diào)節(jié)劑的方法主要有電生理技術(shù)和熒光染料法等，前者因具有直接、靈敏的優(yōu)點(diǎn)而被公認(rèn)為離子通道功能檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”[18]，但其操作繁瑣、成本昂貴，對操作人員技術(shù)要求高，不適用于高通量藥物篩選。而熒光染料如Fluo-3、Fluo-4等[19]與Ca2+結(jié)合后，染料熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，能夠直觀、實時檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，但操作復(fù)雜，試劑費(fèi)用高，實驗周期長，限制了TRPV4調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。

常用的篩選離子通道調(diào)節(jié)劑的方法大多不適用于TRPV4大量化合物庫的高通量篩選。因此，本研究建立了一種基于CaCC的高通量篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的方法，利用TRPV4可以升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度進(jìn)而開放CaCC，細(xì)胞外I-轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，胞內(nèi)黃色熒光蛋白YFP-H148Q/I152L的熒光發(fā)生淬滅的原理，檢測熒光信號可實現(xiàn)對TRPV4調(diào)節(jié)劑的高通量篩選。FRT細(xì)胞具有貼壁緊、胰酶不易消化、生長速度適中、較CHO和COS-7等細(xì)胞更易使膜蛋白表達(dá)的特點(diǎn)，常用于研究氯離子通道及其調(diào)節(jié)劑的高通量篩選[20]，因此本研究選擇FRT細(xì)胞系作為目的細(xì)胞進(jìn)行建模。利用熒光倒置顯微鏡觀察共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞株，ANO1表達(dá)在細(xì)胞膜上，YFP-H148Q/I152L表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，若表達(dá)位置錯誤，F(xiàn)RT細(xì)胞將無法轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外I-且不具備熒光淬滅的生物學(xué)功能，通過熒光淬滅動力學(xué)實驗進(jìn)一步驗證了ANO1表達(dá)在細(xì)胞膜上而非細(xì)胞外，證實了ANO1定位和功能的準(zhǔn)確性。同時，本模型可敏感檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度，用熒光Slope值表征細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，比Fura-2法具有更大的信號窗口且可以更直觀地反映細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化情況。本模型經(jīng)反復(fù)傳代至30代以上，依然保持其穩(wěn)定性，且Z'因子為0.728，能滿足高通量篩選的要求。

本模型只是TRPV4調(diào)節(jié)劑的初篩方法，尚存在一系列不足。本模型在用于TRPV4激活劑的篩選時，可能會篩選出CaCC通道或其他內(nèi)源性Ca2+通道的激活劑，篩選之后還需要通過后續(xù)實驗區(qū)分出假陽性結(jié)果，可應(yīng)用不同激活劑和抑制劑組合在一定程度上區(qū)分結(jié)果的真?zhèn)危糜谝种苿┖Y選時則沒有此問題。由于本模型內(nèi)源性表達(dá)TRPV4，并不表達(dá)TRPV通道的其他蛋白，說明本研究篩選的激活劑和抑制劑均作用于TRPV4，但對于篩選的激活劑和抑制劑是否作用于TRPV通道的其他蛋白仍需后續(xù)實驗進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本模型是高通量篩選TRPV4調(diào)節(jié)劑的新方法，可以快速敏感地檢測細(xì)胞內(nèi)鈣信號的變化，實現(xiàn)對TRPV4調(diào)節(jié)劑的高通量篩選，具有篩選周期短、操作簡便、成本低的優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步研究和開發(fā)TRPV4新型藥物提供了初篩方法，還為其他離子通道調(diào)節(jié)劑的篩選提供了新思路，具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。