不同濃度磷脅迫對大豆幼苗生長及根系DNA甲基化水平的影響

張文獻 李增強 胡亞麗 梁志辰 羅登杰 盧 海 唐美瓊 陳 鵬*

(1.廣西大學 農學院，南寧 530004；2.廣西壯族自治區高校植物遺傳育種重點實驗室，南寧 530004)

磷是植物生長發育必須的三大營養元素之一，參與植物體內眾多化合物的組成及代謝過程，對作物的產量和品質有重要的影響。全世界約有1/2的耕地處于缺磷狀態，我國更是有2/3的耕地缺磷[1]。磷肥的過度施用容易導致環境污染，并且磷資源具有有限性和不可再生性。大豆是重要的糧油兼用作物，同時也是喜磷作物。大豆在低磷脅迫下不但吸收不到足夠的磷素，甚至還會抑制根瘤的生長，降低固氮量[2]，最終嚴重降低大豆的產量和品質。

目前在大豆響應低磷脅迫方面的研究主要集中在大豆農藝性狀的改變和磷效率相關性狀的QTL(quantitative trait loci)定位等方面。嚴重的低磷脅迫會顯著抑制大豆的植株生長，包括株高、莖粗和干物質積累量等顯著降低[3]。但在低磷脅迫下，大豆根長、根表面積和根體積均比正常供磷時有所增加[4]，主要原因可能在于根系是植物吸收土壤水分和養分最直接、最主要的器官，低磷脅迫促使大豆擴大根系的吸收面積，縮短磷離子擴散到根部的距離。因此，通常把根長和根表面積作為篩選磷高效基因型大豆的重要指標[5]。黃蘭蘭等[6]匯總目前已報道的大豆磷效率相關的96個QTL，并將其提交到大豆的公共遺傳圖譜Soymap 2中，為大豆磷效率分子標記的輔助選擇提供重要依據。姚敏磊等[7]研究發現，大豆在低磷脅迫下的差異表達基因主要涉及光合作用、物質和能量代謝、酶活性調節等生物學過程，并推測光合作用在大豆響應低磷脅迫中起著重要的角色。

DNA甲基化在調控基因表達、維持基因組穩定性、調控植物生長發育、生物和非生物逆境脅迫響應等方面發揮著重要作用[8]。甲基化敏感擴增多態性 (methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP) 技術是在擴增片段長度多態性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP) 技術的基礎上發展起來的，現已廣泛運用在植物的基因組DNA甲基化水平研究中[9]。陳智華[10]運用MSAP技術分析了大豆雜交種及其親本的DNA甲基化差異。徐妍[11]運用MSAP技術分析了灰斑病菌脅迫對大豆DNA甲基化水平的影響，表明灰斑病菌脅迫后，大豆葉片的DNA甲基化率降低，并推測DNA甲基化可能在大豆的抗性反應中起著重要的作用。何慶元等[12]運用MSAP技術分析了硫化氫對鹽脅迫下大豆DNA甲基化的影響，表明硫化氫溶液可以恢復鹽脅迫所導致的甲基化類型和水平的改變，從而緩解鹽脅迫造成的傷害。殷欣[13]利用MSAP技術研究了鎘脅迫下大豆的DNA甲基化變化，表明鎘脅迫導致大豆DNA甲基化水平升高，并且甲基化水平與處理濃度呈正相關，推測甲基化差異基因廣泛參與到植物響應逆境的過程。大豆響應非生物脅迫的相關報道主要集中在大豆農藝性狀、多組學以及抗逆性相關基因的研究上，基因組DNA甲基化方面的相關研究卻鮮有報道。本研究利用MSAP和qRT-PCR等技術，系統分析不同濃度的磷脅迫對大豆幼苗生長、生理生化、DNA甲基化和相關基因表達水平的影響，旨在明確磷脅迫下大豆幼苗的長勢及DNA甲基化水平變化等情況，以期為進一步研究大豆高效吸收和利用磷肥的潛在機制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

本試驗以大豆‘CP016’為試驗材料，先采用砂培法培養長勢一致的幼苗用于后續試驗，后采用水培法對幼苗進行不同濃度的H3PO4處理。光照培養箱中培養，光/暗周期為9 h/15 h，溫度25 ℃，光照度20 000 Lx，濕度60%。首先將種子用3%的H2O2消毒并沖洗后，均勻地種植在含有沙土的塑料盆(27 cm×18 cm×9 cm)中，定期定量地澆以蒸餾水。培養5 d后，選出長勢一致的幼苗90株用于本試驗，即為5個處理，每個處理6株，3次生物學重復。把幼苗移栽到盛有育苗盤的托盤中處理10 d，定期定量地更換處理液。處理液以改良Hoagland營養液配方為基礎，把其中的KH2PO4更換為KCl和H3PO4以分別補充鉀和磷。各處理均加74.58 mg/L的KCl以補充鉀，之后分別加不同濃度(0,10,100,500,1 000 μmol/L)的H3PO4進行處理，注意使用氫氧化鈉調節各組處理液的pH 6.0。根據相關文獻[14]中作物的需磷量，本試驗中，500 μmol/L的H3PO4處理作為正常供磷水平，0、10、100和1 000 μmol/L的H3PO4分別作為無磷、極低磷、低磷和高磷脅迫處理。

1.2 植物學性狀及生理指標的測定

測定各處理組幼苗的株高、莖粗和全鮮重等植物學性狀，并利用根系掃描分析儀(EPSON EXPRESSION 10000XL)對根系進行掃描分析，計算根長、根表面積和根體積等。之后將材料保存于-80 ℃冰箱，用于后續試驗。分別采用氮藍四唑法[15]、愈創木酚法[15]和紫外分光光度法[16]測定根系的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性。使用北京索萊寶科技有限公司的淀粉(貨號：BC0700)和蔗糖(貨號：BC2460)含量檢測試劑盒測定根系的淀粉和蔗糖含量。

1.3 甲基化敏感擴增多態性(MSAP)分析

參照Tang等[17]的MSAP方法并略做改進，對部分處理幼苗的根系進行DNA甲基化水平分析。首先采用改良CTAB法[18]提取上述材料的基因組DNA，之后用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ2個組合分別進行雙酶切，連接，預擴增、選擇性擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染和顯色，最后對MSAP多態性條帶進行標記和統計。接頭序列、預擴增和選擇性擴增引物序列，見表1。

MSAP多態性條帶標記方法如下：同一水平線上，EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ酶切都有帶，記為Ⅰ型(無甲基化)；EcoRⅠ/HpaⅡ酶切有帶而EcoRⅠ/MspⅠ酶切無帶，記為Ⅱ型(半甲基化)；EcoRⅠ/HpaⅡ酶切無帶而EcoRⅠ/MspⅠ酶切有帶，記為Ⅲ型(全甲基化)；EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ酶切都無帶，記為Ⅳ型(全甲基化)。DNA甲基化水平統計方法如下：甲基化條帶數=Ⅱ型+Ⅲ型+Ⅳ型，甲基化率=(Ⅱ型+Ⅲ型+Ⅳ型)/(Ⅰ型+Ⅱ型+Ⅲ型+Ⅳ)×100%；半甲基化條帶數=Ⅱ型，半甲基化率=Ⅱ型/(Ⅰ型+Ⅱ型+Ⅲ型+Ⅳ)×100%；全甲基化條帶數=Ⅲ型+Ⅳ型，全甲基化率=(Ⅲ型+Ⅳ型)/(Ⅰ型+Ⅱ型+Ⅲ型+Ⅳ型)×100%。

1.4 qRT-PCR分析

運用改良異硫氰酸胍法分別提取相應材料的RNA[19]，利用瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計檢測RNA的質量和濃度，之后使用南京諾唯贊生物科技有限公司反轉錄試劑盒(貨號：R223-01)反轉錄成cDNA，并以此為模板進行qRT-PCR分析。以β-tubulin為內參基因，采用2-ΔΔCT方法[20]計算基因的相對表達量，qRT-PCR引物序列，見表2。

1.5 數據處理

使用Excel軟件進行數據分析及圖表的制作，使用IBM SPSS Statistics 22軟件進行生物學統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度磷脅迫對大豆幼苗植物學性狀的影響

大豆幼苗經過不同濃度的磷脅迫處理后，植株外部形態差異明顯。其中，無磷(0 μmol/L)和高磷(1 000 μmol/L)脅迫下的幼苗在株高、葉片大小和根系等方面的長勢明顯變差，其他3個濃度處理下的長勢正常。極低磷(10 μmol/L)和低磷脅迫(100 μmol/L)下根系的長勢最好，高磷脅迫下最差。

由表3可知，低磷脅迫下的幼苗株高和鮮重最高，其次是正常供磷(500 μmol/L)、極低磷、高磷和無磷處理，除正常供磷和極低磷處理外，其他處理之間均存在顯著的差異，說明一定程度的低磷脅迫可以促進大豆幼苗的生長。值得注意的是，幼苗在無磷脅迫下莖最粗，高磷脅迫下莖最細，這可能是磷脅迫導致大豆幼苗發生的適應性變化。在幼苗的根系長勢方面，極低磷脅迫下根系的根長、根表面積和根體積值最大，其次是正常供磷、低磷和無磷，4個處理之間總體上無顯著的差異。高磷脅迫下根系長勢最差，且與其他濃度處理存在顯著性差異，說明極低磷和低磷脅迫可以促進大豆幼苗根系的伸長生長，高磷脅迫對根系的抑制大于無磷脅迫。

表1 引物序列Table 1 Lists of primer sequences

表2 實時熒光定量PCR引物序列(5′→3′)Table 2 Primer sequences for qRT-PCR (5′→3′)

表3 不同濃度H3PO4處理對大豆幼苗植物學性狀的影響Table 3 Effects of different concentrations of H3PO4 on botanical characteristics of soybean seedlings

2.2 不同濃度磷脅迫對大豆幼苗根系抗氧化酶活性及碳水化合物含量的影響

由圖1可知，磷脅迫處理顯著改變大豆幼苗根系的抗氧化酶活性和碳水化合物含量。不同濃度磷脅迫下根系的SOD活性呈先升高后降低的趨勢，極低磷(10 μmol/L)和低磷(100 μmol/L)脅迫下的活性最高，其次是無磷和正常供磷(500 μmol/L)處理，高磷脅迫(1 000 μmol/L)下活性最低。POD和CAT活性的變化趨勢基本相同，都呈先降低后升高的趨勢，高磷和正常供磷處理下的活性最高，其次是無磷脅迫，低磷和極低磷脅迫下活性最低。淀粉和蔗糖含量的變化趨勢基本相同，都呈先升高后降低的趨勢。正常供磷處理(500 μmol/L)下根系的淀粉含量最高，其次是低磷和極低磷脅迫，最后是無磷和高磷脅迫。低磷脅迫下根系的蔗糖含量最高，其次是極低磷和正常供磷處理，無磷和高磷脅迫下含量最低，并且低磷脅迫下的蔗糖含量是高磷脅迫下的3倍左右。

2.3 不同濃度磷脅迫對大豆幼苗根系DNA甲基化水平的影響

由圖2可知，大豆幼苗根系在無磷和高磷(1 000 μmol/L)脅迫下均出現甲基化差異片段。由表4和表5可知，隨著磷濃度的逐漸增加，大豆幼苗根系的DNA甲基化率和全甲基化率明顯升高，半甲基化率逐漸降低。正常供磷(500 μmol/L)條件下，大豆幼苗根系的DNA甲基化率、半甲基化率和全甲基化率分別為48.52%、14.35%和34.18%。無磷脅迫使根系的DNA甲基化率和全甲基化率降低，半甲基化率升高。高磷脅迫使根系的DNA甲基化率和全甲基化率升高，半甲基化率降低，但變化幅度較小。由此說明，磷脅迫改變大豆幼苗根系的DNA甲基化水平，且無磷脅迫比高磷脅迫的變化幅度更大。

2.4 甲基化酶及生理生化相關基因的qRT-PCR分析

由圖3可知，Gu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD基因的表達量都是無磷脅迫下比正常供磷(500 μmol/L)處理的低，且前兩者呈顯著性降低。POD、POD4、POD10和POD11基因的表達量都在無磷脅迫下顯著提高，CAT1基因的表達量稍高。說明磷脅迫改變調控抗氧化酶相關基因的表達水平，從而改變抗氧化酶活性，最終在響應磷脅迫中起到重要作用。顆粒結合型淀粉合成酶GBSS(Granule-bound starch synthase, GBSS)和淀粉合酶(Starch synthase, SS)是淀粉合成中的關鍵酶，主要分別負責直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成[21]。GBSS、SS1和SS3基因的表達量都在無磷脅迫下比正常供磷條件下顯著提高。蔗糖合酶SuS(sucrose synthase，SUS)是植物進行蔗糖代謝的關鍵酶之一，對淀粉的合成也具有調節作用[22]。本研究發現SuS、SuS2和SuS5基因的表達量在無磷脅迫下顯著降低，這與測得的蔗糖含量變化趨勢是一致的。

圖1 不同濃度磷脅迫下大豆幼苗根系抗氧化酶活性及碳水化合物含量的變化Fig.1 Changes in antioxidant enzyme activity and carbohydrate content in roots of soybean seedling under different concentrations of phosphorus stress

DRM2和ROS1分別是植物中重要的甲基化酶和去甲基化酶，本研究發現DRM2基因在無磷脅迫下顯著升高，ROS1基因在無磷脅迫下顯著降低，進一步說明磷脅迫使大豆幼苗DNA甲基化水平的顯著變化。

3 討 論

低磷脅迫可以促進大豆植株的伸長生長[23]，但嚴重缺磷會對植株生長產生顯著的抑制[24]。在低磷脅迫下，大豆主要通過刺激根系生長以提高對磷的吸收，以適應低磷環境，磷高效基因型大豆品種更是如此[25]。本研究表明，低磷脅迫促進大豆材料‘CP016’的幼苗生長，極低磷脅迫下幼苗的長勢減弱，但仍能顯著促進根長、根表面積和根體積等，這些都是磷高效品種篩選的重要指標，說明此品種是潛在的磷高效基因型品種，值得深入研究。

植物遭受非生物逆境脅迫后，會使體內積累大量的活性氧。SOD、POD和CAT等共同組成抗氧化酶系統，以緩解活性氧導致的氧化脅迫，但是嚴重的非生物脅迫會使這種抗氧化酶系統紊亂，對植物造成嚴重的損傷[26-27]。本研究中，相較于低磷(100 μmol/L)和極低磷脅迫(10 μmol/L)，無磷和高磷(1 000 μmol/L)脅迫下根系的SOD、POD和CAT活性比正常供磷處理下變化更大，這可能是無磷和高磷脅迫下的幼苗生長受到嚴重抑制的原因之一。碳水化合物是植物光合作用的主要產物，是維持植物生長發育所需的物質和能量主要來源。蔗糖和淀粉在植物生長發育過程中發揮著重要作用[28]。無磷和高磷脅迫下，大豆幼苗的葉片明顯變小，光合產物減少，因而蔗糖和淀粉含量大大降低。但是低磷和極低磷脅迫下幼苗的葉片大小、淀粉和蔗糖含量變化較小，甚至低磷脅迫下幼苗根系的蔗糖含量最高。

M，50 bp Marker；1～6，EcoRⅠ/HpaⅡ酶切產物；7～12，EcoRⅠ/MspⅠ酶切產物。1,2,7,8為0 μmol/L的H3PO4處理的樣品產物；3,4,9,10為500 μmol/L的H3PO4處理的樣品產物；5,6,11,12為1 000 μmol/L的H3PO4處理的樣品產物。白色方框，Ⅰ型(無甲基化)；黑色方框，Ⅱ型(半甲基化)；紅色方框，Ⅲ型(全甲基化)；藍色方框，Ⅳ型(全甲基化)。M, 50 bp Maker; Lanes 1-6, digested with EcoRⅠ/HpaⅡ; Lanes 7-12, digested with EcoRⅠ/MspⅠ. The lane 1,2,7,8; 3,4,9,10; 5,6,11,12 represented the concentration treatments of 0, 500 and 1 000 μmol/L H3PO4, respectively. The white blacke, red and blue frames represented the typeⅠ(non methylation), typeⅡ(hemi-methylation), type Ⅲ(full methylation) and type Ⅳ(full methylation), respectively.圖2 MSAP聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.2 MSAP acrylamide gel analysis

DNA甲基化與植物的生長發育密切相關，植物體內的DNA甲基化水平總是處于一個動態平衡的狀態，其建立和維持的機制與DNA甲基化酶以及DNA去甲基化酶密切相關[29]。DNA甲基化酶主要有3個家族：甲基轉移酶1(MET1)、結構域重排甲基轉移酶(DRM)和染色質甲基化酶(CMT)[30]。DNA去甲基化酶主要有4個家族：DME、ROS1、DML2和DML3[31]。當植物遭受生物或非生物逆境脅迫后，DNA甲基化相關酶基因的表達量會發生顯著變化，從而導致植物體內的DNA甲基化水平改變，以應對嚴峻的脅迫環境[32]。本研究發現，在無磷脅迫下DRM2基因的表達量顯著上調，ROS1基因表達量顯著下調。利用MSAP技術分析發現，無磷脅迫和高磷脅迫分別使DNA甲基化水平降低或提高，表明磷脅迫打破大豆幼苗根系DNA甲基化狀態的動態平衡，這與殷欣[13]對大豆DNA甲基化響應鎘脅迫的研究結果一致。本研究發現高磷脅迫導致大豆幼苗根系DNA甲基化水平升高，而無磷脅迫導致甲基化水平降低，并且變化幅度更顯著，2種脅迫下的半甲基化率變化都較小，這說明了大豆幼苗應對不同脅迫環境DNA甲基化水平變化和響應的復雜性。

表4 MSAP差異片段統計分析Table 4 Statistical analysis of MSAP differential fragments

表5 DNA甲基化水平統計分析Table 5 Statistical analysis of DNA methylation level

圖3 生理生化及甲基化酶相關基因的qRT-PCR分析Fig.3 qRT-PCR analysis of related genes about physiology biochemistry and methylase

本研究系統地比較不同濃度磷脅迫下大豆材料‘CP016’的幼苗長勢、抗氧化酶活性、碳水化合物含量、DNA甲基化水平以及相關基因的表達量變化，并得出施磷量為100～500 μmol/L為宜，且在此范圍內，適度的低磷脅迫可以促進大豆的生長。

4 結 論

本研究首次利用MSAP技術得出大豆材料‘CP016’幼苗根系在正常供磷條件下，DNA甲基化率、半甲基化率和全甲基化率分別為48.52%、14.35%和34.18%。無磷和高磷脅迫分別使大豆幼苗根系的甲基化率和全甲基化率降低或提高，且無磷脅迫對甲基化水平的影響更大。一定程度的低磷脅迫可以促進大豆幼苗，特別是根系的生長。無磷和高磷脅迫均顯著抑制大豆幼苗的生長，可能是由于根系的抗氧化酶系統紊亂，碳水化合物合成減少，DNA甲基化水平變化引起眾多相關基因的表達量發生改變所導致的。