莧菜AmSPL基因家族轉錄組鑒定及表達分析

陳家蘭 趙春麗 王 曉 鄭友峰 賴鐘雄 劉生財

(福建農林大學 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

轉錄因子(Transcription factors, TFs)是在轉錄水平上調控基因表達的DNA結合蛋白。SPL是植物特異轉錄因子的重要組成部分，對植物生長發育過程中起著重要調控作用[1]。這個轉錄因子家族的成員具有一個高度保守的DNA結合結構域，稱為SBP結構域[2]。SBP結構域由約76個氨基酸殘基組成，包含2個鋅離子結合位點(Zn 1和Zn 2)。2個鋅離子結合位點組成一個Cys3HisCys2HisCys或Cys6HisCys，其中第一個鋅指是Cys3His或Cys4，第二個是Cys2HisCys[3]。在金魚草中鑒定出第一個SPL基因，能夠與SQUAMOSA基因啟動子結合來控制花的早期發育[4]。目前，許多陸生植物中已經鑒定出SPL基因，例如水稻[5]、番茄[6]、擬南芥[7]、毛白楊[8]和葡萄[9]等。迄今為止，已知SPLS調節許多植物的生長發育過程，包括葉發育、相變[10]、芽發育[11]、孢子發生、GA信號[12]、銅穩態[13]和花青素的合成[14]等。

MicroRNAs (miRNAs) 對植物基因功能的調節中起著關鍵作用。miRNAs是20～24 bp的內源性單鏈非編碼小RNA分子，在轉錄和轉錄后水平調節基因功能[15]。miRNA是轉錄后水平的調控因子，主要作用于靶基因的3′UTR。一般認為，當miRNA與靶位點完全互補，那么這些miRNA的結合往往引起靶基因mRNA的降解，這在植物中較為常見，而當miRNA與靶基因mRNA不完全互補，可導致miRNA在蛋白翻譯水平上抑制靶基因表達(哺乳動物中較為常見)，miRNAs已被發現在植物中調節生長、發育、代謝、非生物和生物脅迫應答反應[16-17]。

miR156家族成員通過負向調節SPLs，進而調控植物營養生長和生殖生長的轉變、花的發育和漿果果皮顏色的形成。miR156的過表達上調了花青素合成關鍵基因表達，從而促進了花青素在細胞質中合成[18-19]。在擬南芥的SPL基因中有11個具有miR156的靶位點[20]。大多數擬南芥SPL基因miRNA反應元件(MREs)位于保守的SBP結構域的下游，是最后一個外顯子的編碼序列的一部分[21]。在水稻中，Os-miR156靶向11個OsSPL[22]。水稻與擬南芥一樣，除OsSPL4和OsSPL13的靶位點位于3′UTR，大多數MREs都位于編碼區[23]。同樣，番茄中15個SPL基因中有10個被發現是miR156的靶點[24]。莧菜是石竹目莧科莧屬的一年生保健蔬菜，品種繁多，營養價值高，生長速度快，抗逆性強。石竹目植物中紅、黃甜菜色素取代花青素[25]，莧菜莖和葉中富含甜菜紅素，具有較高的營養價值和藥用價值[26]。同時花青素和甜菜色素在許多方面都存在相似之處，包括發生機理、發展模式及色素合成的環境影響因子。雖然有研究報道miR156通過負調控SPL調節花青素合成[14]，但關于SPL是否參與甜菜色素代謝的研究尚未見報道。本研究基于‘全紅’莧菜的轉錄組數據庫(SAR登錄號：SRR11196359-SRR11196364)，利用生物信息學手段對SPL家族進行篩選分析，同時分析莧菜SPL家族與miR156之間的調控模式，旨在明確莧菜SPL家族基因結構特征及響應藍光條件的表達模式，以期為進一步研究和應用莧菜SPL轉錄因子的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

‘全紅’莧菜種子由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供。將‘全紅’莧菜種子均勻地播種于鋪有3層濾紙的塑料培養皿上，加入適量的去離子水，分別放于藍光(25 ℃，24 h/d，光強115.96 μmol/(m2·s))和黑暗(25 ℃)的條件下，培養36～40 h后，取胚軸時期莧菜的莖段作為轉錄組測序的材料，每種處理取樣3次，每次0.1 g，液氮速凍，由深圳華大基因股份有限公司進行轉錄組測序及分析。

1.2 方法

1.2.1數據來源及AmSPL家族基因的鑒定

本課題組測序獲得‘全紅’莧菜轉錄組數據庫，根據測序數據在NT、NR、PFAM和Swiss-Prot 4個數據庫進行關鍵詞搜索，獲得SPL家族相關基因，去除掉重復序列后，運用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在線軟件對候選基因進行保守結構域分析，刪除不含有SPL家族特征結構域的序列[27]。模式植物擬南芥中已知的16個SPL基因的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列從TAIR數據庫(https:∥www.arabidopsis.org/)中下載得到[28]。使用pfam(http:∥pfam.sanger.ac.uk)進行識別AtSPLs的SBP域[27]。

1.2.2AmSPL家族蛋白生物信息學分析

對篩選獲得的SPL蛋白序列進行分析，分別利用在線軟件ProtParam(http:∥web.expasy.org/protparam/)[29]對SOPMA (https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)[30]和Plant-mPLoc Server(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)[31]對氨基酸理化性質、蛋白的二級結構和亞細胞定位進行分析。‘全紅’莧菜SPL家族蛋白的結構域使用SMART進行分析，蛋白結構圖使用IBS軟件作出。

利用在線軟件 MEME Suite 5.0.5(http:∥meme-suite.org/tools/meme)分析‘全紅’莧菜SPL家族蛋白序列的保守結構域[32]。利用軟件MEGA-X構建‘全紅’莧菜SPLs蛋白序列系統進化樹，同時與擬南芥SPL家族蛋白共同構建系統進化樹[33-34]。

利用在線分析軟件psRNATarget(http:∥plantgrn.noble.org/psRNATarget/)對獲得的17個AmSPL的cDNA序列進行miR156的靶向位點預測，期望值設置為5.0，整理后繪制靶位點圖。莧菜miR156序列從small RNA數據庫中獲得。

1.2.3藍光和黑暗處理下莧菜‘全紅’SPL家族基因的差異表達分析

根據藍光和黑暗處理下‘全紅’莧菜胚軸的轉錄組測序數據中的FPKM(Fragments per kilobase per million, 每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的碎片)值，計算出均值后，通過GraphPad Prism 8.0.2軟件對藍光和黑暗處理下莧菜胚軸SPL家族基因的表達數據進行分析。

然后以轉錄組測序的藍光和黑暗處理的‘全紅’莧菜胚軸為試驗材料，對本研究所篩選的SPL基因進行實時定量熒光PCR擴增，選用AmEF1a為內參，檢測AmSPL基因的表達情況，根據SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus，Takara, Japan)試劑盒說明書進行qRT-PCR反應液的配制，在LightCycler480 Real-time PCR 儀器上進行試驗，所有試樣進行3次重復，采用2-ΔΔct的方法計算AmSPLs基因的相對表達量。根據AmSPL特異序列設計上下游定量引物，內參基因及其引物序列，見表1。

表1 qPCR 所用引物序列及退火溫度Table 1 Primer sequences and their annealing temperature used in qPCR

2 結果與分析

2.1 AmSPL家族基因的篩選及蛋白特性

基于莧菜轉錄組數據庫，通過關鍵詞對4個蛋白數據庫的注釋進行搜索，初步獲得52個SPL家族的相關基因，進一步通過SMART分析，最終得到 17個SPL家族基因，為使后續分析更加方便，根據轉錄組編號的順序命名為AmSPL1(CL10801.Contig1_All) ～AmSPL17(Unigene9395_All)。由表2和表3可知，AmSPLs蛋白長度在186～777 個氨基酸，蛋白相對分子量在20.53～88.27 ku，其中有6個AmSPL蛋白屬于酸性蛋白，其余11個為堿性蛋白；除了AmSPL16其余蛋白不穩定系數均>40，表明除AmSPL16，其余均為不穩定蛋白；平均親水系數均為負值，表明17個AmSPL蛋白都是親水蛋白。二級結構分析發現，無規則卷曲占據的比例最大，均>50%，亞細胞定位預測結果均定位在細胞核，并且推測AmSPL4，AmSPL11和AmSPL12同時定位在細胞質中。

表3 AmSPL家族蛋白二級結構和亞細胞定位分析Table 3 Two level structure and subcellular localization of AmSPL family proteins

由圖1(a)可知，17個AmSPL蛋白中有3對基因自展值為100，這表明這3對AmSPL親緣關系非常近，其可能存在功能冗余的現象。SMART分析的AmSPL家族結構(圖1(b))表明AmSPL家族蛋白均含有SBP結構域。

2.2 AmSPL家族結構域分析

SPL家族之間所含保守基序種類和數目存在一定的差別，其中AmSPL1、AmSPL3、AmSPL4、AmSPL5、AmSPL6、AmSPL7、AmSPL8、AmSPL9、AmSPL11、AmSPL14和AmSPL17含有Motif 1，而AmSPL4、AmSPL14、AmSPL17含有Motif 4。出現頻率最高的Motif 1是SPL家族結構域中非常重要的保守基序，SBP結構域，說明本研究篩選得到的17個AmSPL家族成員大都具有SBP結構域。通過Jalview軟件對其序列進行比對和分析(圖2)，發現其在‘全紅’莧菜中高度保守。

2.3 ‘全紅’莧菜與擬南芥SPL家族蛋白系統進化樹

由圖3可知， 33個SPL成員共分為6個組，GroupⅠ含有9個AmSPL家族蛋白，分別為AmSP 4，AmSPL 12，AmSPL 14，AmSPL 17，AmSPL2，AmSPL1，AmSPL15，AmSPL3和AmSPL16，并含有4個AtSPL家族蛋白；GroupⅡ含有AmSPL10和AmSPL8這2個AmSPL家族蛋白，同時含有3個AtSPL家族蛋白；Group Ⅲ含有3個AmSPL家族蛋白，分別為AmSPL 7，AmSPL 5和AmSPL 9，同時含有6個AtSPL家族蛋白；GroupⅣ含有2個AmSPL家族蛋白，分別為AmSPL 6和AmSPL 13；GroupⅤ不含有AmSPL家族蛋白；Group Ⅵ含有1個為AmSPL11。

紅色是SBP結構域，粉紅色是DEXDc結構域，藍色是低復雜區域，綠色是跨膜區。圖中數字表示自展值。Red represents SBP domain. Pink represents DEXDc domain. Blue represents low complex region. Green represents the transmembrane region. Number represents bootstrap value.圖1 AmSPL家族進化樹(a)及蛋白結構分析(b)Fig.1 Phylogenetic tree (a) and structural analysis (b) of AmSPL family proteins

圖2 AmSPL家族蛋白SBP保守結構域Fig.2 SBP conserved domains of AmSPL

不同的分支顏色代表分屬于不同的組。圖中數字表示自展值。Different branch colors represent belonging to different groups. The digital represents bootstrap value.圖3 ‘全紅’莧菜(Am)與擬南芥(At)SPL家族蛋白系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SPL family proteins of Amaranthus ‘Quanhong’ and Arabidopsis thaliana

‘全紅’莧菜和擬南芥分別在GroupⅡ和Group Ⅵ含有1對自展值為100(AmSPL10和AtSPL8，AmSPL11和AtSPL7)的直系同源基因對(圖3)。此外，大部分含有相同基序的蛋白序列被劃分為同一組，相近分枝的SPL蛋白分析，推測它們可能具有相同或相似的功能。

2.4 AmSPL家族基因中miR156作用位點的預測

由圖4可知，17個AmSPL家族成員中有8個成員含有與miR156成熟體互補序列，分別為AmSPL1，AmSPL2，AmSPL4，AmSPL5，AmSPL6，AmSPL7，AmSPL8和AmSPL13，初步表明這8個AmSPLs可能是miR156的靶基因。

圖4 Am-miR156a-5p、Am-miR156-1與8個AmSPLs互補序列的序列比對Fig.4 Sequence alignment of Am-miR156a-5p and Am-miR156-1 with their complementary sequence of 8 AmSPLs

2.5 AmSPL基因家族的表達分析

由圖5可知，AmSPL基因表達豐度各不相同，黑暗條件下大部分的AmSPL基因表達量顯著高于藍光條件下，其中AmSPL1在黑暗處理下的表達量最強；其中AmSPL3的表達量最弱，但在藍光條件下的表達量顯著上升，與其相似度最高的AmSPL16表達量較高，且呈現相反趨勢，說明雖然它們同屬一個基因家族，但功能不同。在藍光條件下，AmSPL11的表達量最高，其余AmSPL的表達量都相對較低。FPKM均值與實時熒光定量PCR結果相比較，除了AmSPL3，AmSPL11，AmSPL12，AmSPL13和AmSPL17，其余的AmSPLs在黑暗和藍光處理下胚軸中的相對表達量趨勢與轉錄組數據的FPKM值相符，并且實時熒光定量PCR結果表明，所有AmSPL基因全都表現為黑暗條件下表達量顯著高于藍光處理的表達量，雖然趨勢率上存在差異，但這些相似的表達模式也表明這些AmSPLs可能存在功能上的冗余，并推測出AmSPLs的表達可能通過受到藍光的負調控，其變化的調控機制還需要進一步研究。

3 討 論

目前基于全基因組研究的深入，越來越多物種的SPL基因家族被鑒定出來，其中擬南芥中發現16個，水稻19個，小麥58個，番茄15個。然而對于沒有全基因組的物種更多的是通過轉錄組進行分析鑒定。SPL是植物的特異性轉錄因子，含有高度保守的SBP結構域[35]，它能夠與花分生組織中的特性基因SQUAMOSA和其同源基因的啟動子特異性結合，從而在植物的生長發育過程中起著重要的調控作用[36-38]。有研究發現，擬南芥miR156的過表達在較低的環境溫度(16 ℃)下導致開花延遲[39]。在miR156的靶基因中，SPL3表達水平主要降低，這可能是因為在16 ℃時，miR156更易使SPL3降解。同時，miR156的過表達植株可上調花青素合成關鍵基因表達，從而促進花青素的合成。本研究在轉錄組范圍內鑒定‘全紅’莧菜的SPL基因，并進行生物信息學分析和表達情況分析。通過鑒定分析，共獲得17個AmSPL家族成員，比擬南芥中的成員數量多1個。通過對AmSPL家族蛋白保守結構域預測，同時與擬南芥進行比較分析，發現許多保守的序列特征，例如，SPL都含有高度保守的SBP結構域，約有78個氨基酸殘基。系統進化分析表明，‘全紅’莧菜和擬南芥共33個SPL蛋白聚成6個類群，除類群Ⅴ，其余每個類群都至少含有1個AmSPL和1個 AtSPL，不同物種間的SPL基因功能具有相似性，也證明SPL家族之間具有一定的功能保守性。Wang等[40]研究表明AtSPL2，AtSPL10，AtSPL11可以調控莖生葉和花的形態特征，在系統發育樹(圖3)中發現，AmSPL2，AmSPL4，AmSPL12，AmSPL14和AmSPL17與AtSPL2，AtSPL10和AtSPL11處于同一個類群，也可能調控莧菜莖生葉和花的形態特征；AtSPL9和AtSPL15可以調控擬南芥幼年到成年生長期的轉變和葉片生長的起始速率[41]，AmSPL8與AtSPL9和AtSPL15屬于同一類群且自展值為100，因此AmSPL8在莧菜中很有可能調控著幼年到成年的轉變。轉錄組的FPKM值與qRT-PCR結果基本一致，藍光條件下的AmSPL家族基因表達量顯著低于黑暗條件下的表達量，同時藍光條件下積累更多的甜菜色素，可推測AmSPL參與莧菜甜菜色素的合成。Yang等[17]研究發現，處于同一組的基因顯示相同或相似的表達模式，其中一些會顯現出差異模式，這也表明植物SPLs具有多樣性，所以SPLs基因在莧菜中的功能還需要進行進一步的探究與鑒定。

*表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。* indicate significant difference in different treatment, at 0.05 level.圖5 莧菜AmSPLs的qRT-PCR定量結果與其對應的FPKM值Fig.5 qRT-PCR quantitative results of AmSPLs and the FPKM values

研究表明植物中的大部分SPL家族基因是 miR156的靶基因，而且miR156/SPL調控模式在調節植物生長發育中起重要作用[42]。擬南芥[10]、番茄[6]、大豆[43]和水稻[22]等植物中SPL家族的大部分成員被證實是miR156的靶基因，本研究也預測17個AmSPLs中有8個是miR156的靶基因，這表明miR156介導的轉錄后調控在植物中具有保守性。這些結果說明miR156對SPL家族調控起著重要的作用。雖然未被預測出其余9個AmSPLs是Am-miR156的靶基因，但也不能排除其存在的可能性。同時也有研究表明miR156靶向SPL轉錄因子對擬南芥花青素生物合成存在負調控[14]， Kishima等[44]早已證明藍光可以誘導甜菜色素的積累，而花青素和甜菜色素的合成在環境影響因子中存在相似之處，本研究中的qRT-PCR結果也顯示藍光條件下AmSPL的表達量均顯著低于黑暗中，因此可以推測藍光誘導miR156過表達從而抑制AmSPL的表達，促進甜菜色素的積累。