外源NO緩解花生鹽脅迫的效果及機理

朱營營 張 倩 董元杰

(山東農業大學 資源與環境學院/土肥資源高效利用國家工程實驗室，山東 泰安 271018)

土壤鹽漬化是抑制植株生長、導致作物減產的重要非生物脅迫因子之一[1]。鹽脅迫導致植物遭受滲透脅迫和離子毒害的原初脅迫，進而引起氧化脅迫和營養虧缺等次生脅迫，影響植物正常生長[2-3]。山東省是我國重要的糧油生產省份，目前山東省黃河三角洲地區擁有鹽漬化土壤44.29萬hm2，且受自然及人類活動影響，濱海地區鹽漬化土地面積越來越大[4]，鹽害嚴重影響著農作物幼苗形態建成和高產穩產，給我國農業生產造成了巨大損失。

添加外源物質提高作物耐鹽性是一個有效便捷的手段[5]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)作為植物體內一種小分子信號物質，參與多種植物生理調控過程，在植物適應逆境脅迫過程中發揮重要作用[6]。鹽脅迫條件下，外源NO能通過增加植物體內滲透調節物質含量穩定細胞結構，緩解鹽脅迫導致的離子失衡[7]；上調抗氧化酶相關基因的表達提高抗氧化酶活性，清除過量的氧自由基，減輕膜脂過氧化損傷[8]，增加葉片光合色素含量來提高凈光合速率，促進植株干物質量的積累和幼苗形態建成，緩解鹽脅迫對植株生長的抑制作用[2]。另有研究表明，外源物質對鹽脅迫下種子萌發的促進作用受外界鹽濃度的影響[9-10]。因此，外源NO的合理施用對提高植物耐鹽性，促進鹽脅迫下植株的生長意義重大。

花生(ArachishypogaeaL.)是我國重要的油料作物，因其中等耐鹽屬性在山東省濱海鹽漬化土壤區有較大栽培面積。研究表明，低鹽脅迫(50 mmol/L NaCl)促進生長，高鹽脅迫(≥100 mmol/L NaCl)顯著抑制生長[11]；另有研究表明，鹽害對花生萌芽期和幼苗期危害最重，花生能耐受的鹽脅迫濃度為0.09～0.12 mol/L[12-13]；所以鹽漬化土壤上出苗難和保苗難是花生生產的主要限制性因子。2018—2019年，我國油脂油料市場受中美貿易戰影響，供給壓力不斷增大，因此，研究方便快捷的新途徑提高鹽脅迫條件下花生苗期耐鹽性，快速提高鹽堿地花生產量，對保障國家糧油安全具有重要意義。

目前有關NO緩解花生幼苗鹽害的效應及其生理機制鮮見報道。本研究以硝普鈉(Sodium-nitroprusside，SNP)為外源NO供體，采用液體培養試驗，測定250 μmol/L SNP緩解花生鹽脅迫的效應，旨在探討提高鹽堿地花生幼苗耐鹽性的有效途徑，以期為山東省濱海鹽漬化土壤區花生抗鹽保苗及優質高產栽培提供理論依據和技術手段。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2019年3月在山東農業大學資源與環境學院植物營養學實驗室進行。供試花生品種為‘山花11號’(山東農業大學花生研究所提供)，選取籽粒飽滿、大小一致的種子，用0.1% NaClO消毒10 min，蒸餾水反復沖洗，置于SPX-2501C 型人工智能氣候箱中25 ℃黑暗恒溫催芽。種子露白后播于生長基質中，萌發后用1/2 Hoagland 營養液澆灌，待花生長出4個真葉后，挑選長勢一致的花生幼苗洗凈根部基質，不去子葉移栽到盛有各處理液的塑料水培桶中進行培養，每盆6株。幼苗室內生長的晝夜溫度分別為25和18 ℃，光照時間14 h/d，光強為100 μmol/(m2·s)。外源NO供體為硝普鈉([Na2Fe(CN)5]·NO，SNP)。

1.2 研究方法

試驗共設6個處理：1) CK，Hoagland營養液；2) T1，Hoagland營養液+100 mmol/L NaCl；3) T2，Hoagland營養液+150 mmol/L NaCl；4) T3，Hoagland營養液+250 μmol/L SNP；5) T4，Hoagland營養液+100 mmol/L NaCl+250 μmol/L SNP；6) T5，Hoagland營養液+ 150 mmol/L NaCl+250 μmol/L SNP。本試驗SNP及NaCl的適宜濃度由預備試驗獲得，每個處理重復3次，每2 d更換1次營養液，用1.0和0.1 mol/L的H2SO4和KOH調節pH至6.3,每盆每次用2 L配置的混合液進行處理，在處理14 d后取樣分析測定。

1.3 測定項目與方法

株高采用常規直尺測量法，鮮干重采用天平稱量法；并采用TTC法測定其根系活力[14]；花生葉片的葉綠素含量測定采用乙醇提取、紫外分光吸收法測定；電解質滲出率采用DDS-307A電導儀測定；可溶性糖含量采用蒽酮法測定，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定，游離脯氨酸含量采用茚三酮法測定[15]。花生葉和根的超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定，抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定參照抗壞血酸比色法[14]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定，超氧陰離子(O2·-)產生速率采用羥胺氧化法測定，過氧化氫(H2O2)含量的提取和測定采用碘量法[14]；一氧化氮(NO)含量及一氧化氮合酶(NOS)活性的測定采用南京建成生物工程研究所試劑盒。

1.4 數據處理

試驗數據采用Excel 2010軟件處理數據；采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，最小顯著極差法 (LSD) 進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗株高、鮮干重及根系活力的影響

由表1可見，與對照(CK)相比，T1與T2處理下的花生幼苗株高、鮮干重和根系活力顯著下降，其中T2處理下鹽脅迫濃度較高，花生各項生長指標與根系活力下降幅度更大，表明鹽濃度越高對花生幼苗生長的抑制作用越強。在T3處理下，花生幼苗各項生長指標與根系活力基本不受外源NO影響；在鹽脅迫下，SNP處理顯著促進花生幼苗生長，其中以T5處理效果最優。與T1相比，T4處理下花生株高、鮮干重和根系活力分別增加6.74%、19.27%、8.55%和20.88%；與T2相比，T5處理下花生株高、鮮干重和根系活力分別增加7.52%、19.36%、12.84%和25.10%。綜上說明鹽脅迫越重，SNP對花生幼苗生長指標與根系活力的緩解效應越強。

表1 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗生長的影響Table 1 Effect of exogenous NO on the growth of peanut seedlings under salt stress

2.2 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗光合色素含量的影響

由表2可知，與CK相比，鹽脅迫能顯著降低花生幼苗葉片的光合色素含量，T1處理下葉片葉綠素總含量下降16.03%；T2處理下花生受高濃度鹽脅迫影響葉綠素總含量下降幅度更大，為21.52%。T3處理下，花生幼苗在添加SNP的營養液中生長，其葉綠素總含量與CK相比呈下降趨勢，下降了5.13%；而鹽脅迫下添加SNP能顯著提高葉片葉綠素總含量，其中以T5處理效果最優。與T1處理相比，T4葉片葉綠素總含量提升10.73%；與T2處理比，T5葉綠素總含量升高12.08%。T5處理下花生葉綠素總含量增幅最大，葉片葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量的變化趨勢與葉綠素總含量一致。表明鹽脅迫越重，SNP對光合色素含量的保護效應越強。

表2 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗光合色素含量的影響Table 2 Effect of exogenous NO on photosynthetic pigment content ofpeanut seedlings under salt stress mg/g

2.3 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗O2·-產生速率及H2O2含量的影響

由圖1(a)可知，與CK相比，T3處理下花生體內的O2·-產生速率小幅上升，表明正常情況下添加SNP會對花生產生毒害作用，輕微抑制其生長；T1和T2處理下花生體內的O2·-產生速率顯著增加，其中T2處理提升幅度最大，表明在試驗濃度范圍內，花生體內O2·-產生速率與遭受的鹽脅迫程度成顯著正相關。外源添加SNP能緩解鹽脅迫對花生幼苗造成的氧化損傷，其中以T5處理效果最優；T4與T1處理相比，葉片和根系O2·-產生速率分別降低10.60%和28.92%；T5與T2處理相比，葉片和根系O2·-產生速率分別下降12.04%和32.83%；表明SNP對較高濃度鹽脅迫造成的氧化損傷緩解效果更優。

由圖1(b)可見，正常生長情況下添加SNP處理(T3)的花生H2O2含量提升幅度不顯著；受鹽脅迫影響，T1和T2處理下花生葉片和根系H2O2含量顯著高于CK，T2處理下花生H2O2含量最多，嚴重抑制幼苗生長。外源NO能有效降低花生體內H2O2含量，緩解NaCl脅迫導致的過氧化損害，與T1處理相比，T4花生葉片和根系的H2O2含量降低37.99%和29.43%；與T2處理相比，T5葉片和根系的H2O2含量降低29.32%和44.86%。發現T5處理下H2O2含量降低速率最快，緩解效果最優，說明鹽脅迫越重，外源NO清除活性氧的能力越強。

CK， 0 mmol/L NaCl； T1， 100 mmol/L NaCl； T2， 150 mmol/L NaCl； T3， 250 μmol/L SNP； T4， 100 mmol/L NaCl+250 μmol/L SNP； T5， 150 mmol/L NaCl+250 μmol/L SNP。下同。The same below.圖1 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗葉、根中O2·-產生速率(a)和 H2O2含量(b)的影響Fig.1 Effect of exogenous NO on O2·- production rate (a) and H2O2 content (b) in leaves and roots of peanut seedlings under salt stress

2.4 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗膜質過氧化的影響

由圖2(a)可知，與CK相比，鹽脅迫下花生葉片和根系的MDA含量顯著增加，尤其是T2處理下鹽脅迫濃度較高，進一步促進MDA的積累。與CK相比，T3處理花生幼苗MDA含量無顯著變化；而鹽脅迫下添加SNP能有效降低花生體內MDA含量，減輕由鹽脅迫誘導的細胞膜損傷。T4與T1處理相比，葉片和根系MDA含量分別降低14.05%和20.82%；T5與T2處理相比，葉片和根系MDA含量分別下降15.01%和20.97%；其中T5處理下MDA含量下降速率更快，表現出更好的緩解效果。

圖2 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗丙二醛含量(a)和葉片電解質滲透率(b)的影響Fig.2 Effects of exogenous NO on MDA content (a) and leaf electrolyte permeability (b) of peanut seedlings under salt stress

由圖2(b)可知，與CK相比，鹽脅迫處理下花生幼苗的電解質外滲率顯著上升，其中T2處理下鹽脅迫濃度更高，其電解質滲透率上升幅度更大。鹽脅迫下添加SNP能有效降低花生體內的電解質外滲率，緩解鹽脅迫引起的質膜損傷，其中以T5處理效果最優；T4與T1處理相比，葉片電解液滲透率下降17.49%；與T2處理相比，T5葉片電解液滲透率下降17.61%，說明在本試驗的濃度范圍內，鹽脅迫越重，外源NO對鹽脅迫誘導的細胞膜損傷的緩解能力越強。

2.5 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，與CK相比，正常生長條件下添加SNP處理(T3)的花生幼苗中SOD、POD、CAT和APX酶活性下降，但降低幅度不顯著。由于花生對外界鹽脅迫的生理響應，T1和T2處理的幼苗體內SOD、POD、CAT和APX活性顯著降低，其中T2處理受鹽脅迫濃度較高，各酶活性降低幅度最大。外源NO能有效提高不同鹽濃度下花生體內的抗氧化酶活性，其中T5處理下各抗氧化酶活性提升速率最快。與T1處理相比，T4葉片與根系的SOD活性提高12.12%和3.19%；POD活性提升60.92%和34.11%；CAT活性提高54.76%和21.75%；APX活性提升23.72%與44.35%。與T2處理相比，T5葉片與根系的SOD活性提高9.84%和9.80%；POD活性升高64.82%和58.35%；CAT活性提高91.84%和66.06%；APX活性提升26.09%和49.46%。分析數據表明，在本試驗的濃度范圍內，鹽脅迫越重，外源NO對抗氧化酶活性的提升作用越強，對氧化損傷的緩解作用越大。

圖3 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗SOD (a)、POD (b)、CAT (c)及APX (d)酶活性的影響Fig.3 Effect of exogenous nitric oxide on SOD (a), POD (b), CAT (c) and APX (d) activities of peanut seedlings under salt stress

2.6 外源NO對鹽脅迫下花生體內滲透調節物質的影響

由表3可見，與CK相比，SNP單獨處理(T3)對花生葉片中滲透調節物質的積累無顯著影響；而鹽脅迫處理下，葉片游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量均顯著增加，尤其是T2處理下鹽濃度較高，花生體內各滲透調節物質的增加幅度更大；鹽脅迫下添加SNP能進一步增加滲透調節物質在植物體內的積累，降低細胞滲透勢，提高細胞保水能力，減輕鹽害作用，以T5處理效果最優。與T1處理相比，T4葉片游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量分別提高27.30%、9.15%和56.02%；與T2處理相比，T5上述各指標分別提高60.73%、22.56%和30.43%。說明在本試驗的濃度范圍內，鹽脅迫越重，外源施用NO更有利于花生體內滲透調節物質的積累。

表3 外源NO對鹽脅迫下花生葉片滲透調節物質的影響Table 3 Effect of exogenous NO on osmotic adjustment substancesin peanut leaves under salt stress

2.7 外源NO對鹽脅迫下花生體內NO及NOS的影響

由圖4可見，與CK相比，正常生長條件下添加SNP(T3)后，花生葉片和根系中NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性均顯著增加，尤其是葉片NO含量較CK增加31.32%；鹽脅迫條件下，添加SNP能有效提高花生體內NO含量和NOS活性，其中以T5處理效果最優。T4與T1處理相比，葉片和根系NO含量分別增加33.09%和27.49%；T5與T2處理相比，葉片和根系NO含量分別增加41.83%和35.45%。由于NO與NOS之間具有相互調控作用，添加SNP后花生葉片和根系NOS活性顯著降低，T4與T1處理相比，葉片和根系NOS活性降低17.22%與14.18%；T5與T2處理相比，葉片和根系NOS活性分別降低29.13%和23.45%。表明添加外源NO能提高花生幼苗內源NO含量，緩解鹽害，其中T5處理下內源NO提升速率最快，鹽脅迫越強，SNP刺激植物產生內源NO的能力越強。

圖4 外源NO對鹽脅迫下花生幼苗NO及NOS的影響Fig.4 Effect of exogenous nitric oxide on NO and NOS in peanut seedlings under salt stress

3 討 論

3.1 外源NO對NaCl脅迫下花生幼苗鮮干重、根系活力及光合色素的影響

鹽脅迫下花生光合作用減弱、碳同化能力降低直接影響體內有機物合成，產生了幼苗節間縮短，干物質積累量減少等一系列問題，嚴重抑制植物正常生長[2,16]。蔣明義等[17]證實逆境條件下，植株體內活性氧增多造成的氧化損傷是導致葉綠素降解和生長受抑制的主要原因。肖強等[18]證實了NO對植株葉綠素具有保護效應，這種保護效應存在濃度效應，即低濃度保護，高濃度抑制。本研究表明正常條件下添加SNP輕微抑制花生生長；而鹽脅迫下花生幼苗株高、鮮干重、根系活力及光合色素含量下降，添加SNP能有效緩解鹽害對幼苗生長的抑制作用，且外源NO緩解較高濃度鹽脅迫對花生生長影響的效果更優。這可能是由于正常條件下添加SNP，植株內源NO過高導致葉片葉綠素降解，光合作用減弱，不利于植株生長發育；而鹽脅迫條件下，外源NO作為一種信號分子，能快速誘導植株體內抗氧化酶活性增加，緩解鹽害對質膜的氧化損傷，抑制葉片葉綠素分解，從而提高植株的光合效率，更有利于植株干物質量的積累和幼苗形態建成[16,19]；且SNP有效性受外界鹽濃度的影響，鹽濃度越高SNP清除自由基、抑制葉綠素分解和緩解鹽害的效果越強。這與已有對水稻[18]、核桃[20]和番茄[21]的研究結果一致。

3.2 外源NO對NaCl脅迫下花生幼苗抗氧化酶及活性氧代謝的影響

植物體內的ROS(O2·-和H2O2)和MDA含量在應激反應中會超過閾值水平，加劇膜脂過氧化程度，抑制多種生理過程，對植物造成損害[8]，因此必須清除活性氧來維持植株正常代謝功能，活性氧的清除依賴于抗氧化酶提供的解毒機制。Tariq等[22]研究發現，植株體內的SOD與CAT協同作用把O2·-歧化為H2O2；H2O2在后續反應中被H2O2清除酶POD轉化為H2O。Jian等[19]研究表明，NO可以直接或間接作用于廣泛的靶標，快速上調植物體內關于抗氧化酶活性的基因的表達，以減輕鹽脅迫引起的氧化損傷和光合損傷[8]。另有研究表明，高濃度的NO可以和SOD歧化反應競爭，導致ONOO-的形成，損傷細胞[18]。本研究表明，正常條件下外源SNP對花生會產生輕微毒害作用，不利于花生生長；鹽脅迫下添加SNP能提高花生體內抗氧化酶活性，減輕ROS誘導的細胞損傷，從而減輕膜脂過氧化程度，緩解鹽脅迫對花生生長的抑制作用，這與前人對小麥[2]和水稻[18]的研究一致。這可能是由于正常生長條件下添加SNP，過高濃度NO能在植物體內生成強氧化性的過氧亞硝酸鹽，還能引發自由基鏈式反應，損傷細胞。本試驗進一步表明，NaCl2+SNP處理下花生體內的抗氧化酶活性增加更快，清除活性氧、緩解鹽害效果更優；這可能是由于鹽脅迫條件下，NO能快速誘導花生體內增強抗氧化酶活性基因的轉錄，抑制過量氧自由基的生成速率能夠更好地保護細胞質膜免受氧化損傷，抵御鹽害，促進花生生長，外界鹽脅迫越重，NO誘導基因表達的功能越強；但關于添加NO能快速誘導花生幼苗中哪些基因的表達來增強植株抗鹽性至今鮮見報道，仍需進一步研究。

3.3 外源NO對NaCl脅迫下花生幼苗滲透調節物質的影響

土壤中鹽濃度過高使植物根外環境中水勢降低，植株遭受滲透脅迫引起生理干旱，嚴重影響正常生長發育[2,7]。已有研究表明，植物在遭受鹽害時，其對逆境環境的適應性使其體內脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量上升，有效提高細胞液濃度，降低細胞滲透勢，提高細胞保水能力，增加原生質膠體的穩定性，以此緩解鹽脅迫[2,19]；脯氨酸還可作為自由基清除劑穩定生物分子結構，以及膜和酶的保護物質，降低細胞酸性來緩解植物鹽害[6]。本研究結果表明，正常條件下添加SNP對花生有輕微毒害作用；鹽脅迫下添加SNP能顯著提高花生體內滲透調節物質含量，維持膨壓緩解鹽害；且花生在更高濃度鹽脅迫下積累滲透調節物質速率更快，緩解鹽害效應更強。這可能是由于，正常條件下添加SNP使得花生體內NO濃度過高產生逆境脅迫；鹽脅迫下添加SNP有利于花生幼苗體內滲透調節物質的合成與積累，促進細胞吸收水分，使原生質膠體更加穩定，同時減弱自由基對質膜的損傷，減輕滲透脅迫對花生幼苗生長的危害；SNP緩解鹽害的有效性受外界鹽濃度的影響，導致較高鹽濃度下，花生滲透調節物質的積累速率更快，緩解鹽害效果更優。這與在核桃幼苗[20]和裸燕麥[19]上的研究結果一致。

3.4 添加外源NO對鹽脅迫下花生幼苗內源一氧化氮的影響

植物在逆境脅迫下主要通過NOS來合成NO，NO可作為信號分子來調控鹽脅迫下植株的生理反應[19]，有研究表明NO能夠通過調節抗氧化酶基因的轉錄來保護細胞質膜免受氧化損害，以及上調根系質膜H+-ATPase基因的表達來阻止Na+的吸收和轉運[23]，所以NO含量的增加能顯著提高植物的耐鹽能力。Song[24]等研究結果表明，存在于細胞質中的NOS可以合成NO，高濃度的NO會抑制NOS的生理合成途徑，NO與NOS之間具有相互調控作用。本研究發現正常生長下添加SNP會增加花生植株內源NO含量，輕微抑制花生生長；鹽脅迫下花生體內NOS活性提升，內源NO含量增加，抵抗鹽害，添加SNP能進一步提高內源NO含量，但葉和根內NOS活性下降，且花生受較高濃度鹽脅迫危害時，SNP促進內源NO產生的速率更快。這可能是由于內源NO作為生物活性信號傳遞分子，能夠調控抗逆基因表達，參與鹽脅迫下植株抗氧化酶及活性氧代謝、離子動態平衡等多種生理代謝過程，在較高濃度鹽脅迫下，NO可以通過正向調控基因、進一步促進表達，所以緩解鹽害效果更佳。

4 結 論

1)正常生長條件下，添加外源NO使花生內源NO濃度較高對幼苗生長產生輕微毒害作用；但鹽脅迫下添加外源NO，能顯著提高花生幼苗體內的滲透調節物質含量、光合色素含量以及抗氧化酶活性，減少活性氧和丙二醛的積累，維持膜結構的相對穩定，從而提高花生苗期耐鹽能力，促進幼苗生長。

2)外源NO對花生幼苗鹽脅迫的緩解作用受外界鹽濃度影響，花生遭受150 mmol/L NaCl脅迫時NO緩解膜脂過氧化損傷的速率更快，耐鹽性更強。但是本試驗條件下，T4處理的生物量高于T5處理，表明花生幼苗在較高鹽濃度下的生長指標受鹽脅迫影響更大，外源NO無法完全逆轉鹽脅迫對花生幼苗產生的傷害。