不同體況對妊娠初期母牛陰道菌群的影響

劉 波 斯木吉德 王純潔 阿日查 張 劍 陳 浩 何利娜 張 晨 崔銀雪 敖日格樂*

(1.內蒙古農業大學 動物科學學院，呼和浩特 010018；2.內蒙古農業大學 獸醫學院，呼和浩特 010018)

肉牛的體況評分是評價一頭肉牛個體能量存儲情況以及肉牛能量平衡程度的重要方法，是目前廣泛應用的評估肉牛體能儲備是否平衡的實用方法，是肉牛飼養管理中不可缺少的工具[1]。體況對母牛的繁殖機能會產生重要影響，在整個繁殖周期中維持肉牛適宜的體況，既能保持其良好的繁殖性能，又能降低飼養成本，取得較好的經濟效益[2]。周貴等[3]研究表明，為取得理想的繁殖性能，繁殖母牛的體況應保持在2.5～3分(5分制)或5～6分(9分制)的范圍內。

妊娠初期在整個妊娠期內有重要作用，有研究表明妊娠初期陰道菌群發生紊亂會顯著增加早產和流產風險，妊娠初期的陰道菌群狀態可以預測妊娠結局[4-5]。姜宏星等[6]研究表明奶牛產前產后的體況直接影響本胎次乃至終生的繁殖水平，體況過肥或偏瘦均會造成奶牛繁殖力下降。周穎等[7]研究表明母豬在妊娠期保持中等體況繁殖性能較好。李元剛等[8]研究發現在妊娠初期保持母貂中等體況有助于發揮其繁殖性能。因此在妊娠初期保持良好的體況是很重要的。牛的陰道中存在大量種類繁多的微生物及多種常駐菌。正常情況下，這些常駐菌群與宿主、環境之間相互協調、相互作用、相互制約，共同維持陰道的平衡狀態[9]。這種平衡狀態與牛的生殖健康緊密相關，一旦遭到破壞，如外界環境、自身激素水平和免疫力的改變，就會引發一些繁殖障礙疾病[10]。劉暢[9]研究發現健康、體況良好的肉牛陰道細菌有氣球菌、綠色氣球菌、睡眠嗜血桿菌、多動物鏈球菌、嗜冷桿菌、大腸桿菌和鞘氨醇單胞菌，黃體期和卵泡期陰道菌群結構有差異。Mateus等[16]研究指出，與未妊娠的奶牛相比，妊娠期的奶牛往往表現出較低的陰道菌群Alpha多樣性。Gunay等[11]研究發現狗卵泡期陰道細菌數量顯著高于黃體期。

然而到目前為止，關于牛微生物區系的研究主要集中在胃腸道，而對于不同體況放牧肉用繁殖母牛妊娠初期陰道菌群結構的研究尚未見報道。對于肉牛養殖來說，保持繁殖母牛擁有較好的繁殖力，對擴大種群以及提高養殖效益具有重要意義。而擁有較好繁殖能力的前提是母牛在妊娠期間保持良好的體況，如果過肥或者偏瘦則會引起難產、出生犢牛體質瘦弱、成活率低等問題，同時良好的陰道菌群結構可以降低繁殖障礙疾病的發生率。因此本研究在妊娠初期通過對不同體況肉牛陰道菌群結構的研究，了解繁殖母牛陰道菌群組成以及是否有致病菌異常增加，對發展肉牛健康養殖、降低繁殖障礙疾病發病率和提高繁殖力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在內蒙古自治區錫林郭勒盟烏拉蓋草原選擇相同放牧條件下2～3 胎身體健康的妊娠初期西門塔爾母牛18 頭。采用9分制評分標準[12]將其分為3組，每組6 頭分別為FC(肥胖組),7～8分、MC(標準組)，5～6分、TC(偏瘦組)，3～4分。

1.2 樣品采集

在樣品采集之前，先用清水將牛外陰部清洗干凈，然后用25%碘溶液對外陰部進行消毒，避免糞便污染。使用本實驗室自制取樣器采集樣品。將棉拭子置于陰道2/3處1 min，使棉拭子與陰道分泌物充分接觸，將棉拭子取出后放在1.5 ml離心管中，迅速放于液氮中并送回實驗室，以便細菌DNA提取。

1.3 指標測定及數據分析

將粘有陰道分泌物的棉簽置于離心管中放置于干冰上送往北京諾和生物信息科技有限公司。對341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)的16S rRNA V3～V4區域進行擴增測序。詳細步驟見參考文獻[13]。利用Barcode區分樣本序列，在對各組樣本序列進行過濾。利用Uparse軟件(Uparse V7.0.1001)對所有有效數據進行OTUs聚類和物種分析，所有聚類均在默認為97%的相似度下進行。使用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線，使用Qiime軟件(Version 1.9.1)進行Alpha多樣性及菌群結構分析，Alpha 多樣性指數包括豐富度指數(Chao1 指數、ACE指數)、多樣性指數(Simpson指數、Shannon 指數)和覆蓋率(Good’s coverage 指數)。利用Beta多樣性分析評價樣品在物種復雜性方面的差異，對OTU數據進行主坐標分析(Principle coordination analysis，PCoA), 使用層次聚類方法非加權組平均法(Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)構建系統發育樹，對距離矩陣進行解釋，結合細菌群落柱狀圖，研究不同組間或樣品間的菌群相似性和分類學差異性[14]。

數據采用Excel 2016整理，采用SPSS 20.0軟件進行方差分析，并以P<0.05進行顯著性檢驗，結果均以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 測序結果及α多樣性分析

通過Illumina HiSeq 測序平臺測序對陰道細菌16S rRNA基因V3-V4高變區進行測序分析，18 份樣品平均每個樣品測得70 567條有效序列，經過質控平均得到 68 309 條序列，質控有效率達96.84%。以97%的一致性將序列聚類成為OTUs，共得到2 677 個OTUs，對OTUs序列與Silva132數據庫進行物種注釋。注釋結果中，共有37.58%的OTU注釋到門水平；32.84%的OTU注釋到科水平；24.36%的OTU注釋到屬水平。

通過繪制稀疏曲線來評判測序數據量是否足以反映樣品中的物種多樣性(圖1)，隨著測序深度的增加，在測序量達到32 000時，曲線趨向平坦，說明取樣的數量合理，測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種，且能夠很好地反映出所有樣品的細菌群落結構和多樣性。

表1顯示了不同體況陰道菌群Alpha多樣性指數，直接反映微生物群落的豐度及多樣性。Shannon值越大，生物多樣性越高；Simpson值越低，表明生物多樣性越高；Chao1指數和ACE指數是估計物種總數的常用指數，值越大，生物多樣性越高。Good’s coverage表示樣本的測序深度。標準組陰道分泌物微生物群落的Alpha多樣性指數的Shannon指數、Chao1指數和ACE指數均顯著低于肥胖組和偏瘦組(P<0.05)，Simpson指數差異不顯著(P>0.05)，表明標準組體況較好，機體內分泌正常、陰道內環境趨于穩定，物種多樣性處于較低水平。各組陰道菌群的Good’s coverage指數均在99.4%以上，顯示樣本測序質量較高，未被檢測到的可能性極低，足以檢測陰道分泌物樣本中的微生物群落信息。

不同顏色代表不同樣品Different samples were represented by different colors圖1 18份樣品的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve of 18 samples

表1 不同體況妊娠初期母牛陰道菌群α多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of vaginal flora of cows in early pregnancy with different body conditions

2.2 β多樣性分析

β多樣性分析是對不同樣本的微生物群落構成進行比較分析。主坐標分析反映了各樣本中菌群構成的相似性。基于Weighted Unifrac距離進行PCoA分析(圖2)，并選取貢獻率最大的主坐標組合進行作圖展示。如果樣本距離越接近，表示物種組成結構越相似，因此群落結構相似度高的樣本傾向于聚集在一起，群落差異較大的樣本則會遠遠分開。由圖2可知，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的貢獻率分別為總變量的58.86%和18.89%，肥胖組(FC)、標準組(MC)、偏瘦組(TC)幾乎聚在一起，差異不顯著(P>0.05)。

橫縱坐標分別為第一和第二主成分，百分比表示主成分對樣品差異的解釋率；圖中的每個點表示一個樣品，同一組的樣品用同一種顏色表示The abscissa and ordinate were the first and second principal components respectively, and the percentage represents the interpretation rate of the principal component to the sample difference; each point in the diagram represents a sample, and the samples of the same group were shown in the same color圖2 各組樣品基于Weighted Unifrac距離PCoA分析Fig.2 Weighted Unifrac distance PCoA analysis for each group of samples

2.3 陰道菌群構成及豐度分布

2.3.1門水平陰道菌群分布豐度

由表2可知，不同體況妊娠初期繁殖母牛陰道分泌物中10大優勢菌門分別是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、無壁菌門(Tenericutes)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、未知菌(Unidentified_Bacteria)、螺旋體菌門(Spirochaetes)和Melainabacteria。厚壁菌門在肥胖組、標準組、偏瘦組的豐度分別為54.16%、56.38%和57.03%，擬桿菌門在3組的豐度分別為24.56%、30.04%和22.37%，變形菌門在3組的豐度分別為3.86%、3.14%和5.83%。而在非優勢菌門中，無壁菌門在肥胖組、標準組、偏瘦組的豐度分別為1.34%、2.06%和1.72%；放線菌門在3組的豐度分別為1.63%、1.67%和1.79%；梭桿菌門在3組的豐度分別為1.80%、1.25%和1.23%；疣微菌門在3組的豐度分別為0.58%、0.35%和0.70%；未知菌在3組的豐度分別為0.50%、0.36%和0.89%；螺旋體菌門在3組的豐度分別為0.31%、0.25%和0.22%； Melainabacteria在3組的豐度分別為0.26%、0.15%和0.20%。結果表明，陰道菌群隨著體況不同而發生變化，偏瘦組變形菌門分布豐度高于標準組和肥胖組，擬桿菌門的分布豐度標準組高于肥胖組和偏瘦組，但差異不顯著(P>0.05)；其他菌門分布豐度無明顯變化，差異不顯著(P>0.05)。

表2 門水平上陰道菌群豐度Table 2 Abundance of vaginal microbiota at phylum level %

2.3.2屬水平陰道菌群分布豐度

在屬水平上，由于屬的種類多且部分屬的相對豐度較低，因此僅對排名前10的屬進行分析。由表3 可知，不同體況妊娠初期繁殖母牛陰道分泌物中10大優勢菌屬分別是擬桿菌屬(Bacteroides)、阿利斯佩斯菌屬(Alistipes)、氣球菌屬(Aerococcus)、費氏菌屬(Faecalibacterium)、鏈桿菌屬(Streptobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、嗜組織菌屬(Histophilus)、脲原體菌屬(Ureaplasma)和支原體屬(Mycoplasma)。擬桿菌屬在肥胖組、標準組、偏瘦組的豐度分別為3.79%、4.26%和3.38%；阿利斯佩斯菌屬在3組的豐度分別為2.78%、2.71%和2.15%；氣球菌屬在3組的豐度分別為1.15%、0.85%和1.12%；費氏菌屬在3組的豐度分別為0.73%、0.73%和0.33%；鏈桿菌屬在3組的豐度分別為0.63%、0.80%和1.13%；鏈球菌屬在3組的豐度分別為0.58%、0.17%和0.48%；棒桿菌屬在3組的豐度分別為0.51%、0.48%和0.29%；嗜組織菌屬在3組的豐度分別為0.03%、0.99%和0.27%；脲原體屬在3組的豐度分別為0.17%、0.20%和0.14%；支原體屬在3組的豐度分別為0.04%、0.09%和0.01%。結果表明，隨著體況的不同，標準組嗜組織菌屬分布豐度顯著高于其他2組(P<0.05)、擬桿菌屬分布豐度高于其他2組，氣球菌屬分布豐度低于其他2組，偏瘦組鏈桿菌屬分布豐度高于其他2組，但差異均不顯著(P>0.05)。

表3 屬水平上陰道菌群豐度Table 3 Abundance of vaginal microbiota at genus level %

3 討 論

本研究利用16S rRNA高通量測序技術，對不同體況妊娠初期繁殖母牛的陰道菌群的豐度和多樣性進行了比較。結果表明，體況的不同對母牛陰道微生物區系結構有一定影響，菌群豐度各不相同。通過Alpha多樣性指數分析，標準組母牛陰道菌群多樣性低于肥胖組和偏瘦組。從PCoA分析結果來看，標準組和肥胖組菌群相似性較高，但和偏瘦組差異不大。Wang等[15]研究表明，患有子宮內膜炎奶牛陰道Alpha多樣性指數顯著高于健康奶牛，這與子宮內膜炎的發生過程一致，即由優勢菌支配的微生物群落結構被破壞，病原菌數量增加，子宮內膜炎發病的一個重要因素是陰道內的細菌擴增進入子宮。而標準組體況母牛機體狀況良好，機體為妊娠提供了較好的環境保障，陰道內環境相對其他兩組較為穩定，因此菌群結構維持在較低水平。通過對門水平上菌群結構分析發現，標準組陰道主要菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門。Laguardia-Nascimento等[16]研究指出不同品種妊娠和非妊娠牛陰道菌群主要由厚壁菌門(40%～50%)、擬桿菌門(15%～25%)、變形菌門(5%～25%)和未知菌門(10%～20%)組成。這與本研究基本吻合，擬桿菌門和無壁菌門有助于子宮內膜的恢復[17]。牛易受到各種病原體引起的與生殖道有關的疾病的影響，如類桿菌屬、支原體、嗜組桿菌屬、梭桿菌屬、鏈球菌屬等[18,19-20]。球菌屬通常定植在哺乳動物的皮膚和粘膜上，也存在于口腔、腸道、泌尿生殖道和上呼吸道[21]。支原體屬和脲原體屬廣泛定植于動物泌尿生殖道黏膜上，并不會引起任何癥狀，而當機體免疫力低下時會引發炎癥[22]。Funke等[23]研究認為棒狀桿菌是人類正常皮膚菌群的一部分。傳統培養方法研究發現，健康牛陰道菌群主要由鏈球菌屬、葡萄球菌屬、腸桿菌屬、乳桿菌屬及少量真菌組成[24-25]。侯榮倫[26]研究健康奶牛生殖道菌群發現乳酸菌是主要優勢菌，且不孕癥奶牛生殖道內乳酸菌數量低于健康奶牛。在本試驗中，雖然檢測出乳酸桿菌屬，但其含量在3個組中均屬于偏低水平，未在圖表中展示。這與劉暢[9]的研究結果一致，肉牛陰道中存在少量的乳酸桿菌屬。標準組嗜組織菌豐度顯著高于肥胖組和偏瘦組，其他菌屬差異不大。雖然有研究表明該菌可能是引起奶牛子宮內膜炎的因素之一且病因不明確[27]，但本試驗所選母牛均為未患繁殖障礙疾病牛，只在體況上進行區分，因此可能是其他因素導致該菌豐度增加，這也說明了陰道中存在少量致病菌并不足以致病，但可以使養殖者及時了解母牛陰道菌群中有害菌是否有升高的趨勢。因為牛的外陰部位于肛門的正下方，經常會被排出的糞便所覆蓋，而外陰部的開口可能會使糞便中的少量致病菌進入，有研究證明，許多生殖道疾病均是由糞便中微生物引起[28-29]。本試驗中檢測出的少量費氏桿菌屬和阿利斯佩斯菌屬也有可能是在樣品采集之前已經通過糞便進入陰道[30-31]。由于本試驗結果中肥胖組、標準組和偏瘦組陰道菌群的主要優勢菌門和優勢菌屬組間差異并不顯著，可能是因為本試驗所選母牛均為體質健康并處于妊娠初期階段，而體況對母牛在妊娠初期階段陰道內環境穩態影響不大進而導致主要優勢菌門和優勢菌屬豐度處于正常水平差異不顯著，但在妊娠初期保持母牛陰道內環境穩定仍是十分重要的，可在之后的試驗中對妊娠中后期不同體況母牛陰道菌群進行測定，進一步探索體況對陰道菌群的影響。

研究表明，陰道微生物群落通過生物屏障、產生乳酸、細菌素和過氧化氫等多種機制在維持生殖道健康方面起著至關重要的作用[32-33]。機體會受到多重因素的影響從而導致陰道菌群結構發生變化，這些因素包括基因、自身的防御屏障系統、年齡、品種、免疫功能、激素分泌等[7]。體況過肥或過瘦會影響血液離子、激素、營養物質代謝水平，降低機體免疫力和繁殖性能[34]，從而對妊娠初期母牛陰道微生物穩態產生影響。而陰道微生物菌群失調可能是引發陰道炎和生殖道感染的重要因素，從而損害生殖性能，造成重大的經濟損失[35]。另外致病性細菌感染可引發子宮內膜炎最終導致胚胎早期死亡，嚴重阻礙繁殖母牛繁殖力。盡管抗生素已經被廣泛應用于雌性動物繁殖疾病，但細菌耐藥性和抗生素殘留等問題正變得越來越突出[36]。Kavyashree等[37]研究發現對陰道菌群鑒定篩查可以有效調控奶牛生殖健康。因此，可通過對體況過肥和偏瘦的妊娠母牛分群管理，對于體況過肥的母牛可適當縮短其放牧采食時間，減少其能量攝入，逐步使體況恢復到標準體況范圍，而對于體況偏瘦的母牛則延長其放牧時間或者收牧后進行適量補飼，進而增重到標準體況，進而使繁殖母牛在妊娠初期避免過肥或過瘦、保持良好的體況，同時明確微生物區系在生殖道健康中的作用和了解妊娠初期菌群結構對防治生殖道感染具有重要意義，可通過提早對不良體況繁殖母牛進行陰道微生物檢查，盡早發現可能引起繁殖疾病的菌群變化，及早預防，降低繁殖障礙疾病發生的概率，減少損失。

4 結 論

利用基于微生物16S rRNA基因測序技術，探索了不同體況妊娠初期繁殖母牛陰道菌群變化情況。本研究發現，標準體況母牛陰道微生物多樣性和豐度最低，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門分別為肥胖組、標準組和偏瘦組主要的優勢菌門，擬桿菌屬均為肥胖組、標準組和偏瘦組主要的優勢菌屬，不同體況母牛陰道微生物群落組成與結構均有變化并存在少量致病菌，但是差異不顯著。本研究為使母牛在妊娠初期保持良好體況并有利于繁殖性能的發揮，同時為養殖者及時了解牛陰道菌群隨體況變化提供了重要基礎數據。