不同消毒方式對土壤酶活性及土傳病原真菌消減的影響

運翠霞 嚴昌榮 徐明澤 劉恩科 MORMILE Pasquale 董雯怡 劉 勤*

(1.中國農業科學院 農業環境與可持續發展研究所， 北京 100081；2.農業農村部農膜污染防控重點實驗室， 北京 100081；3.北京市昌平區農業環境監測站，北京 102200；4.意大利國家科學委員會 應用科學及智慧系統研究所，意大利 羅馬 00185)

設施農業的發展為我國提高作物產量、促進農民增收、消除貧困和加快農村經濟發展發揮了不可替代的作用[1]。據國家統計局數據顯示，我國草莓栽培面積從2002年6.670萬hm2增加到2018年11.997萬hm2。規模化的生產導致作物倒茬輪作困難，草莓連作問題日益嚴重，出現作物生長發育不良、土傳病害加重的現象。連作栽培容易造成土壤理化性質劣變和土壤養分失衡，引起植物生長發育異常，導致產量與品質下降[2]。引起連作障礙的最主要原因是土壤中病原物的多年累積[3]。多年連作導致土傳病原菌累積種類多、數量大，在土壤中存活時間長，土傳病害的發生具有隱蔽性，而且大多數在草莓結果期達到發病高峰，導致草莓減產甚至絕收[4]。

草莓種植主要采用化學藥劑氯化苦和棉隆熏蒸土壤，以解決由土傳病蟲害引起的產量逐年下降、品質逐年降低的重茬問題[5]。土壤熏蒸劑可有效殺滅土壤中的病原物，但在熏蒸的過程中也會抑制土壤中有益生物和影響非生物物質的化學轉化過程[6]。已有研究表明化學藥劑熏蒸土壤后，嚴重破壞非靶標微生物類群，顯著降低土壤酶活性和肥力，以及改變土壤微生物群落結構[7-10]。此外，常年大量的施用化學農藥，污染作物生長環境、破壞土壤微生物生態系統，同時大量的農藥殘留，造成了食品污染，進而危害人體健康[11]。因此，尋求高效環保的新型土壤消毒技術，降低土壤中病原菌數量而改善土壤環境已經成為目前綠色農業發展的研究熱點。

活性炭是竹炭、木炭、椰子殼等炭化形成的炭粉，植物種類不同炭化后的活性也有差異，效果較好的是炭化椰子殼[12]。土壤施用活性炭后，有利于土壤中有益微生物的生長，抑制病原菌的繁殖，起到消毒殺菌的作用，是一種環保型土壤消毒技術[13]。活性炭的添加可提高作物產量和改善果實品質，但是活性炭量的過量增加也會對作物產生脅迫作用，從而抑制作物的正常生長[14]。Pasquale等[15]在太陽能高溫消毒的基礎上，通過在土壤表面撒施一層活性炭和覆蓋太陽輻射膜，模擬熱太陽能電池板，其原理與增加土壤中水溫的方式相同，此方法可以在較短的時間內獲得較高的土壤溫度并具有較好的殺菌效果。而關于采用活性炭+太陽輻射膜覆蓋用于草莓連作地土傳病害防治的相關研究尚未報道。因此，本試驗以北京市昌平區興壽鎮華香園草莓種植基地多年種植草莓的連作土壤為研究對象，采用棉隆、氯化苦熏蒸劑和活性炭+太陽輻射膜覆蓋三種土壤消毒方法，研究不同土壤消毒方法對土壤酶活性、土壤肥力以及土傳病原菌消減的變化，對比不同土壤消毒方式對大棚草莓連作障礙的防治效果，以期為草莓綠色生產提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地基本概況

試驗在北京市昌平區興壽鎮華香園草莓種植基地開展。全年平均日照時數為2 684 h，平均氣溫為11.8 ℃，降水量為550.3 mm，四季分明，屬暖溫帶大陸性季風氣候。試驗溫室長50 m，寬8 m，連作草莓10 年以上，上茬草莓于2019年5月收獲。土壤基本理化性質為：有機質19.59 g/kg、全氮0.76 g/kg、速效磷25.77 mg/kg、速效鉀335 mg/kg、pH 7.44、電導率(EC)236.42 μs/cm。

1.2 試驗設計及樣品采集

供試材料為98%棉隆微粒劑、99.5%氯化苦液劑和顆粒大小為10 目的活性炭，具有高聚熱性能的太陽輻射膜來源于意大利國家科學委員會應用科學及智慧系統研究所。

試驗于2019年6月29日開始，共設6個處理：T1：棉隆(450 kg/hm2)；T2：氯化苦(450 kg/hm2)、T3：活性炭(100 kg/hm2)+太陽輻射膜、T4：活性炭(200 kg/hm2)+太陽輻射膜、T5：活性炭(300 kg/hm2)+太陽輻射膜、CK：不施藥劑。每個處理重復3次，每個小區20 m2，隨機區組排列，整地后將每個處理起壟隔開。具體操作如下：

1)棉隆微粒劑采用“全田混土法”施藥，將藥劑均勻撒施于土壤中，旋耕機進行旋耕，其深度為20～25 cm，使棉隆藥劑與耕層土壤充分混勻后，灌水使土壤含水量達50%～80%，最后覆膜熏蒸；

2)氯化苦采用機械注射法施藥。使用專用施藥機將氯化苦注射入土壤中，注射深度為15～20 cm，間距為25 cm。然后采取“反向壓膜法”將塑料膜四周密封，防止氣體泄漏，同時關閉大棚風口進行熏蒸處理；

3)“活性炭+太陽輻射膜”的消毒需在處理前一天將土壤澆透，將活性炭均勻噴灑在土壤表面，覆蓋太陽輻射膜。悶棚期間，在距地表下5、15、25 cm深度處埋入地溫探頭，設定每隔30分鐘自動記錄一次溫度數據。7月20日揭膜敞氣，同時挖取探頭。揭膜后，采用5點取樣法分別從各小區取土樣，取0～10 cm、10～20 cm的土樣混勻，用冰盒裝好帶回測試。

1.3 測定項目及方法

土壤的基本理化性質：根據鮑士旦[16]的標準方法進行分析測定。

土壤酶活性參照關松蔭[17]的方法測定；土壤蛋白酶采用茚三酮比色法，土壤脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，土壤蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法。

土傳病原菌的測定：土傳鐮刀菌屬(Fusariumspp.)的分離采用Komada等[18]方法測定。土傳疫霉屬(Phytophthoraspp.)的分離采用Masago等[19]方法測定。

病原菌減退率=(對照病原菌數-處理病原菌數)/
對照病原菌數×100%。

1.4 數據處理及分析

采用Excel 2010軟件對試驗數據進行整理，用SPSS 19.0軟件進行方差分析，并采用Duncan法進行不同處理樣本間差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方式對土壤溫度的影響

圖1為土壤消毒期間不同土層日均溫。由圖1可見：土壤的平均溫度隨著土層深度的增加而呈現下降趨勢；不同處理的土壤平均溫度變化趨勢總體表現為T4和T5處理顯著高于其他處理，T4和T5處理土壤溫度之間無顯著性差異，而與T3處理存在顯著性差異，由此可看出高劑量的活性炭+太陽輻射膜覆蓋可增加土壤溫度。表明不同消毒方式對土壤溫度的影響不同，而施用高劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋有利于土壤溫度的增加，使得溫室內土壤溫度升溫更快、更高，更容易達到病蟲的致死溫度，對各種土傳病原菌有良好的防治效果。

CK：不施藥劑；T1：棉隆(450 kg/hm2)； T2：氯化苦(450 kg/hm2)、T3：活性炭(100 kg/hm2)+太陽輻射膜；T4：活性炭(200 kg/hm2)+太陽輻射膜；T5：活性炭(300 kg/hm2)+太陽輻射膜。柱形上不同小寫字母表示不同土層各處理間差異顯著，P<0.05。下同。CK, no medicine; T1, dazomet (450 kg/hm2); T2, chloropicrin (450 kg/hm2); T3, active carbon (100 kg/hm2) mulched solarizing film; T4, active carbon (200 kg/hm2) mulched solarizing film; T5, active carbon (300 kg/hm2) mulched solarizing film. Different lowercase letters on the column indicate significant differences between treatments in different soil layers, P<0.05. The same below.圖1 不同消毒方式下不同土層平均溫度的變化Fig.1 Changes of the average temperature of soil layers under different disinfection methods

土壤最高溫度及持續時間反應高溫悶棚的效果(圖2)。從5、15和25 cm土層內地溫的變化可以看出，高溫悶棚過程中，在土壤中添加了高劑量活性炭和覆蓋太陽輻射膜的T4和T5處理地溫都較其他的溫度高，尤其是14：00時的地溫表現明顯，5、15和 25 cm 深處分別可達60.0、51.6和44.2 ℃(圖2)。并且隨著土層深度的增加，土壤溫度逐漸降低，25 cm土層處一天內溫度變化幅度較小(圖2c)。說明高劑量活性炭的添加和太陽輻射膜的覆蓋可以改善土層結構，提高土壤溫度，增加悶棚效果。

圖2 消毒期內不同處理不同土壤深度下5 cm(a)、15 cm(b)和25 cm(c)的溫度變化Fig.2 Changes of soil temperature at different soil depths of 5 cm (a), 15 cm (b) and 25 cm (c) during disinfection

2.2 不同土壤消毒方式對土壤養分的影響

不同消毒方式處理對土壤養分含量變化如表1所示：在0～10 cm土層，與CK相比，T1和T2處理后，土壤有機質和全氮含量無顯著變化(P>0.05)；速效磷含量顯著降低，分別降低38%和26%；而對于土壤速效鉀含量，T1處理后無顯著變化，T2處理后速效鉀含量顯著降低了11%。不同劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋(T3、T4和T5)處理后，土壤全氮、速效鉀和速效磷含量較CK相比均無顯著性變化(P>0.05)。隨著活性炭量的添加，T3和T4處理后土壤有機質含量無顯著變化，而T5處理顯著增加了有機質含量，增幅為11%。在10～20 cm土層上，與CK相比，T1處理土壤有機質含量與CK相比無顯著性差異，而其他處理均顯著降低了有機質含量；不同消毒方式對土壤全氮含量均無顯著性差異；對于土壤速效鉀，T2處理顯著降低了其含量，T1(棉隆)和不同劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋(T3、T4和T5)對其含量無顯著性差異；T1和T2處理顯著降低了土壤速效磷的含量，分別降低了34%和20%，而不同劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋(T3、T4和T5)對其含量無顯著性差異(P>0.05)。

表1 不同消毒方式對不同土層土壤養分的影響Table 1 Effects of different disinfection methods on soil nutrients at different soil layers

2.3 不同消毒方式對土壤酶活性的影響

2.3.1對蔗糖酶活性的影響

土壤經不同消毒方式處理后，不同土層中蔗糖酶活性變化見圖3。由圖3可見：0～10 cm土層，T1、T2、T3和T4處理均顯著降低了蔗糖酶活性，而T5處理后蔗糖酶活性高于CK處理，其增幅為30%。10～20 cm土層內，T5處理顯著增加了其活性，達71%。而其他消毒方式處理后與CK無顯著性差異。這表明T5(活性炭+太陽輻射膜覆蓋)可增加土壤中蔗糖酶活性。

圖3 不同土壤處理方式對不同土壤深度蔗糖酶活性的影響Fig.3 Effects of different soil treatment methods on sucrase activity at different depths

圖4 不同土壤消毒方式對不同土壤深度脲酶活性的影響Fig.4 Effects of different soil disinfection methods on urease activity at different depths

2.3.2對脲酶活性的影響

土壤脲酶活性與土壤中氮素循環密切相關，主要將尿素水解生成NH4+，供給作物吸收利用。由圖4可以看出：0～10 cm土層內，T1和T2處理顯著降低了土壤脲酶活性，分別達17%和23%，而不同劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋(T3、T4和T5)處理脲酶活性變化不大。在10～20 cm土層，與CK相比，T1和T2處理顯著降低其活性，降幅分別為14%和17%；而對于添加不同劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋處理，低劑量的活性炭則會導致脲酶活性下降。

2.3.3對蛋白酶活性的影響

由圖5分析可得，0～10 cm土層內，T5處理與CK相比無顯著性差異，而其他處理較CK相比，均顯著降低了蛋白酶的活性，降幅分別達21%、46%、51%和35%。而在10～20 cm土層中，T4和T5處理的蛋白酶活性與CK無顯著性差異(P>0.05)，而T1、T2和T3與CK相比，顯著降低了其酶活性，降幅分別達26%、37%和37%。結果表明：施用棉隆(T1)和氯化苦(T2)降低了土壤中蛋白酶活性，從而影響土壤中氮的礦化過程和有機含氮化合物的水解。

圖5 不同土壤消毒方式對不同土壤深度蛋白酶活性的影響Fig.5 Effects of different soil disinfection methods on protease activity at different soil depths

2.4 不同消毒處理對土傳病原菌的影響

2.4.1不同消毒方式對鐮刀菌屬真菌的影響

從表2可以看出，不同土層鐮刀菌發生均較嚴重，且土層越深發病越嚴重。0～10 cm和10～20 cm土層，化學熏蒸劑T1(棉隆)和T2(氯化苦)處理土壤中鐮刀菌的消減效果均在98%以上。不同劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋(T3、T4、T5)處理，在 0～10 cm土層中土壤中鐮刀菌的消減效果分別為93%、99%、99%；在10～20 cm土層中土壤中鐮刀菌的殺滅效果分別為76%、86%、92%。說明活性炭+太陽輻射膜覆蓋對鐮刀菌有一定的防除效果，且T4和T5處理與化學熏蒸劑T1(棉隆)和T2(氯化苦)處理相比，對鐮刀菌的消減效果無顯著差異(P>0.05)。

表2 不同土壤消毒方式對不同土壤深度鐮刀菌的消減效果Table 2 Reductien effects of Fusarium spp. by different soil disinfection methods at different layers

2.4.2不同消毒方式對疫霉菌屬真菌的影響

不同消毒方式處理土壤之后，分離測定疫霉菌數量如表3。在0～10 cm土層，與CK相比，化學藥劑棉隆(T1)和氯化苦(T2)對疫霉菌的防效達95%以上；而對于不同劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋處理，隨著活性炭量的添加，對疫霉菌的防效越佳。10～20 cm土層上，2種化學熏蒸劑對于疫霉菌的消減效果均達99%以上，不同劑量的活性炭添加后的消減率隨著活性炭的添加而增加，其中以T5處理的防效最佳。

表3 不同土壤消毒方式對不同土層疫霉菌的消減效果Table 3 Reduction effects of Phytophthora spp. by different soil disinfection methods at different soil layers

3 討 論

3.1 土壤消毒對溫度和養分的影響

李英梅等[20]研究表明不同消毒方式對土壤溫度和土壤養分有著顯著的影響。本研究發現隨著活性炭量的添加土壤溫度也增加，土層越淺，土壤溫度升溫越快，這可能與活性炭的孔隙結構、較大比表面積和覆蓋高聚熱性能的太陽輻射膜有關，與Pasquale等[15]研究結果一致。楊葉青等[21]研究表明棉隆和氯化苦在有效控制土壤中有害線蟲種群數量的同時，對有益線蟲和土壤養分有明顯的負作用。本研究結果顯示棉隆消毒后土壤速效磷含量顯著下降，而土壤有機質、全氮和速效鉀含量無顯著性變化，與曾祥國等[22]研究結果相一致。然而，也有研究報道施用化學藥劑熏蒸土壤之后，土壤酶活性顯著下降且微生物數量顯著減少，從而導致土壤養分含量降低[23]。造成這一結果差異的原因很可能來自于棉隆施用劑量的差異及土壤質地的差異。本研究表明氯化苦熏蒸后土壤速效磷和速效鉀含量均顯著降低。由此推斷，氯化苦作為一種警戒性農藥，熏蒸過程中殺死了一些有利于土壤養分循環的微生物，降低土壤酶活性，從而影響土壤肥力的產生。活性炭是植物炭化后形成的一種空隙結構發達的炭質材料，其主成分除了碳以外還有氫、氧、氮等元素，施用活性炭可增加土壤氮、磷含量，促進作物的生長發育[24-26]。本研究中發現低劑量的活性炭+太陽輻射膜覆蓋會對土壤養分有抑制作用，高劑量活性炭+太陽輻射膜覆蓋增加了土壤速效磷和全氮的含量，而對于添加活性炭的最適劑量還需要進一步的試驗驗證。

3.2 土壤消毒對酶活性的影響

土壤酶是土壤中植物、動物和微生物的活動產物，其參與土壤中營養物質轉化、有機質分解、污染物降解以及土壤修復等方面，是評價土壤質量和健康狀況的重要指標[27]。其中：土壤脲酶是參與土壤氮素轉化的關鍵酶，可以培肥土壤，對提高氮肥利用率具有重要意義；蔗糖酶活性強弱可反應土壤熟化程度和肥力水平，對增加土壤中易溶性物質起重要作用，而其活性大小與土壤有機質、氮、磷、鉀含量，微生物數量以及土壤呼吸強度等密切相關[28]；土壤蛋白酶作為分解土壤有機含氮化合物重要的水解酶，不僅是土壤氮礦化過程的限速酶，而且其活性還能反映土壤的環境質量狀況[29]，因此這三種酶對于維持土壤正常生理活動具有重要意義。然而，化學熏蒸劑在有效殺滅土傳病原菌和線蟲等有害生物的同時；另一方面也抑制了多種酶活性、降低土壤中非靶標微生物的數量和活性和顯著改變微生物的群落結構以及功能多樣性，破壞土壤生態系統的平衡[30-31]。熏蒸后的土壤有可能會被病原菌二次侵染，致使消毒效果持續性差[32]。本結果顯示施用熏蒸劑棉隆和氯化苦均顯著降低了土壤酶活性，與范琳娟等[33]研究結果一致。連作土壤中添加活性炭可提高酶活性，并改善土壤生物學環境[34-36]。在連作土壤中加入活性炭對土壤酶活性的影響，顯示添加活性炭可增加土壤蔗糖酶活性，蔗糖酶活性與土壤有機質、氮、磷含量，微生物數量以及土壤呼吸強度息息相關[37]。活性炭對連作棉田土壤酶活性的影響表明，土壤中加入活性炭會使土壤生物活性改善明顯，對土壤蔗糖酶活性有促進作用[36]。本研究中活性炭的添加提高了蔗糖酶活性，其原因是活性炭改變了土壤養分含量、pH等，從而引起蔗糖酶活性的變化。棉隆和氯化苦處理均降低了土壤脲酶活性，可能是棉隆和氯化苦易與土壤酶分子結合，形成穩定的復合物，抑制底物與酶分子的結合，導致脲酶活性降低，由此延緩尿素水解成氨，影響作物對氨的吸收[37-39]，其機理還需進一步研究。添加活性炭對脲酶活性影響不大，這與高丹美等[40]研究結果一致。本試驗中施用棉隆和氯化苦均降低了土壤中蛋白酶活性，應與棉隆的降解產物異硫氰酸甲酯對蛋白酶的鈍化作用有關[22]。氯化苦熏蒸顯著降低了土壤中蛋白酶活性，與馬濤濤等[41]研究結果不一致的原因可能與大田試驗與室內恒溫培養試驗的微環境條件不同有關，也可能與前茬種植作物以及日常施肥管理等措施不同有關。

3.3 土壤消毒對土傳病原真菌的影響

化學藥劑熏蒸土壤，對根結線蟲以及土壤病原真菌疫霉菌、鐮刀菌均具有較好的防效[33,42-44]。本研究也發現化學藥劑棉隆與氯化苦熏蒸后顯著減少了土壤中鐮刀菌和疫霉菌的數量，對土傳病原菌達到了較好的防治效果。棉隆作為一種常見的異硫氰酸甲酯產生物，可以迅速殺滅土傳病原線蟲、真菌、地下害蟲[21]；而氯化苦是一種高毒化學農藥，進入生物體組織后，能生成強酸性物質，使細胞腫脹腐爛，還可使細胞脫水，細胞內蛋白質沉淀，使細胞中毒死亡，對害蟲的成蟲、幼蟲熏殺力很強，從而有效防治作物重茬病害[45-48]。物理升溫防治病原菌的研究表明大多數病原菌的致死溫度為39～43 ℃[49]。因此，在高溫季節耕地休閑時期對土壤覆蓋塑料薄膜，通過溫室效應吸收太陽輻射熱來提高土壤溫度從而殺死土壤中的有害生物[50-51]。李英梅等[52]研究的壟溝式太陽能消毒主要是通過增加土壤的采光面，提高土壤溫度，從而有效殺滅土壤中的病原菌。本研究中悶棚期間土壤表面撒施活性炭并且覆蓋太陽輻射膜后的土壤溫度可達到殺病原菌的溫度。土壤表面撒施的活性炭(太陽能集熱器)和具有高聚熱性能的塑料膜覆蓋，比傳統的太陽能消毒法使土壤更快、更容易升溫，從而在更短的時間內殺滅土壤病原菌。

4 結 論

化學熏蒸劑在對土傳病原菌鐮刀菌和疫霉菌具有較好的防除效果，但是也破壞了土壤養分、微生物生存環境，降低土壤酶活性。而利用活性炭+太陽輻射膜覆蓋對土壤進行消毒處理，在對土傳病原菌達到一定防除效果的同時，隨著活性炭的添加也適當增加土壤養分和激活土壤酶活性，為作物生長發育提供了良好的生存環境和所需的養分，也為實現草莓連作障礙的綠色防控提供了新途徑。