基于聲輻射力脈沖彈性成像技術初步探索肝纖維化小鼠肝剪切波速

陳高峰，高志玲，樓唯薇，黃凌鷹#，金樹根

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院1. 肝病研究所，2. 超聲診斷科，3. 肝病科，4. 細胞免疫室，上海 201203)

彈性成像除超聲和磁共振二大類外，還有光和機械壓力傳感器等。在超聲四大彈性成像技術即瞬間彈性成像（transient elastography，TE）、聲輻射力脈沖彈性成像（acoustic radiation force impulse imaging，ARFI）、實時組織彈性成像（real-time tissue elastography，RTE）和實時剪切波彈性成像（real-time shear wave elastography，SWE）中，應用于肝纖維化檢測的Fibroscan和FibroTouch是采用TE技術開發的，其中FibroTouch是TE與二維超聲影像技術結合。雖然Fibroscan和FibroTouch廣泛應用于臨床肝病患者的肝纖維化檢測和療效評價觀察，但臨床實踐發現炎性反應因素影響檢測結果[1]。迄今為止，Fibroscan和FibroTouch仍不能在大鼠和小鼠的肝纖維化實驗中應用。僅有一項研究采用TE技術研發出一種瞬間微彈性成像技術，成功應用于檢測小鼠四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化和淀粉樣變性模型[2]。與Fibroscan和FibroTouch僅限于檢測肝纖維化不同，理論上ARFI可檢測其他組織器官彈性變化。目前，ARFI的聲觸診組織量化已被應用于大鼠腸[3]、肝[4-5]、眼[6]和腦[7]組織炎性損傷、脂肪變性和纖維化檢測的動物實驗， 但未見應用于小鼠肝纖維化檢測的報道。本研究采用ARFI技術檢測CCl4誘導小鼠肝纖維化時肝內剪切波速變化，評估其作為一種可替代肝活檢的實時、非創傷性診斷肝纖維化方法的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠 40 只，6周齡，體質量（24±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK（滬）2017-0005]。小鼠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心[S Y X K（滬）2014-0008]，飼養室溫度25～26 ℃，相對濕度 50%～60%，光照周期明暗各12 h，自由飲食。適應性飼養一周后開始實驗。

1.2 試劑

CCl4購自國藥集團化學試劑有限公司，采用市售食用油（福臨門一級大豆油，中糧集團生產）配成質量分數為1%；異氟烷（isoflurane）購自河北一品制藥股份有限公司。

1.3 主要儀器設備

呼吸麻醉機（中國瑞沃德，R500）、彩超儀（德國西門子，SC2000）、小動物光聲成像系統（加拿大Fuji，LazrX)、脫水機（德國萊卡，ASP 300S）、包埋機（德國萊卡，EG1150H）、切片機（德國萊卡，RM2235）、顯微鏡（日本奧林巴斯，D P 7 1）及其圖像處理分析系統（MediaCybernetics, Image-Pro Plus）。

1.4 CCl4染毒制備肝纖維化模型及分組

10只雄性小鼠作為對照組，自實驗開始采用食用油（0.1 mL/20 g 體質量）隔日一次灌胃，共8周。4周組（1 5只）在實驗1～4周，采用上述食用油隔日一次灌胃，實驗第5周開始灌胃CCl4食用油混合液（250 μL/kg）染毒，隔日一次，共4周。8周組（15只）在實驗第1周開始灌胃CCl4食用油混合液（250 μL/kg）染毒，隔日一次，共8周。實驗8周后各組均正常飼養2周。實驗結束，處死小鼠并收集肝組織樣本，之前12 h禁食不禁水。

1.5 多模式小動物光聲成像系統B超檢測肝灰度

用4%的異氟烷誘導麻醉小鼠后，用1.5% 的異氟烷維持麻醉小鼠。采用多模式小動物光聲成像系統，高頻線陣探頭，頻率40 MHz，觀察小鼠肝右葉同一區域，讀取肝灰度值。

1.6 ARFI法檢測肝內剪切波速

如前麻醉狀態下，采用西門子Acuson S2000彩色多普勒超聲診斷儀，9L4高頻線陣探頭，頻率9 MHz，觀察各小鼠肝右葉同一區域，等待圖像保持平穩后，切換UPDATE按鈕，自動計算出結節內感光區域剪切波的速度。

1.7 肝組織HE與天狼猩紅膠原染色

肝組織經中性甲醛緩沖液固定，石蠟包埋。HE染色：石蠟切片，切片厚度為4 μm，二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液水化，蒸餾水洗3～5 min，Harris蘇木精染色15 min，自來水洗3～5 min，5%鹽酸乙醇溶液分化10 s，水洗藍化 3～5 min，鏡檢細胞核，伊紅復染10 s，梯度脫水，二甲苯透明，封固。天狼猩紅膠原染色：石蠟切片，切片為4μm厚度，二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液水化，蒸餾水洗3～5 min，天狼猩紅染色液滴染15 min，無水乙醇分化，二甲苯透明，封固。膠原染色陽性面積分析：采用Olympus DP71顯微數碼CCD采集圖片，用Image-Pro Plus 6.1進行肝組織膠原面積（反映纖維化）半定量分析。

1.8 數據處理

所有數據均采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，組間差異比較采用方差分析法，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CCl4染毒4周和8周時B超檢測小鼠肝灰度和肝內剪切波速變化

正常小鼠的肝超聲灰度為0.6，染毒4周、8周時肝超聲灰度均為1.6左右（圖1）；正常小鼠肝內剪切波速為0.6～0.8，染毒4周、8周時小鼠肝內剪切波速均在2.6～2.8。

2.2 CCl4染毒4周和8周后正常飼養2周時肝內剪切波速變化

與對照組比，CCl4染毒4周和8周后正常飼養2周時肝內剪切波速依次增加（均P＜0.05），各組肝內剪切波速變化見圖2和表1。

2.3 CCl4染毒4周和8周后正常飼養2周時小鼠肝組織病理改變

CCl4染毒4和8周后正常飼養2周時肝纖維化半定量分析結果見表2。

與正常組（圖3 A、D）比，4周組（圖3B、E）肝細胞的細胞質疏松，匯管區沒有明顯炎性細胞聚集，匯管區膠原纖維變粗向肝實質伸入；8周組（圖C、F）肝細胞的細胞質疏松明顯，匯管區炎性細胞聚集，膠原纖維變粗且向肝實質伸入，形成典型的P-P、P-C纖維間隔（假小葉形成）。

圖 1 CCl4染毒4周和8周時小動物光聲成像系統LazrX檢測小鼠肝超聲灰度值Figure 1 The gray scale value of liver ultrasound in mice at 4 and 8 weeks after CCl 4 exposure was detected by photoacoustic imaging system LazrX

圖 2 CCl4染毒4周和8周后正常飼養2周小鼠肝內剪切波速Figure 2 The intrahepatic shear wave velocity at 2 weeks of normal feeding after CCl 4 exposure for 4 and 8 weeks

表 1 CCl4染毒4周和8周后正常飼養2周時肝內剪切波速Table 1 The intrahepatic shear wave velocity (SWV) at 2 weeks of normal feeding after CCl4 exposure for 4 and 8 weeks

表 2 CCl4染毒4周和8周后正常飼養2周時小鼠肝纖維化Table 2 The liver fibrosis semi-quantitative analysis of mice at 2 weeks of normal feeding after CCl4 exposure for 4 and 8 weeks

圖 3 CCl4染毒4周和8周后正常飼養2周時小鼠肝組織病理改變Figure 3 The pathological change of mouse liver tissues at 2 weeks of normal feeding after CCl 4 exposure for 4 and 8 weeks

3 討論

采用小動物光聲成像系統LazrX對肝纖維化造模小鼠檢測發現，CCl4染毒4周、8周肝纖維化模型小鼠肝實質灰度相近，同時采用ARFI技術檢測CCl4染毒所致的肝纖維化小鼠肝剪切波速，發現結果與小動物光聲成像系統LazrX肝內灰度檢測結果完全一致。考慮低劑量CCl4染毒肝損傷多在24 h前后達最高峰，肝內炎性壞死2周后消失，幾乎接近正常[8]。在CCl4染毒4周、8周后正常飼養2周再進行肝剪切波速檢測，發現肝內剪切波速在CCl4染毒8周后正常飼養2周組＞CCl4染毒4周后正常飼養2周組>正常對照組，與肝內纖維化改變相一致。上述結果與臨床檢測發現肝功能異常可致肝彈性檢測硬度明顯上調，隨肝功能恢復正常而肝彈性檢測硬度下調[9-12]完全一致。除了實時與非創傷性，考慮ARFI還能檢測肝以外其他器官組織[3,6-7]。因此，只要排除炎性損傷改變，ARFI可作為替代活檢的診斷纖維化的有效方法。換言之，因為急性炎性損傷也能導致超聲成像的剪切波速改變[13-16]，所以可利用此特點將ARFI技術應用于急性肝等組織器官損傷的臨床診治和抗肝等組織器官損傷的藥物篩選中。目前，已開展對CCl4中毒大鼠急性肝損傷進行ARFI法動態檢測肝內剪切波速變化的研究，旨在建立一個實時、非創傷性抗急性肝損傷的藥物篩選平臺。

另外，考慮SC2000檢測剪切波速時取框大而且固定不可調小，因此實驗動物應盡量選擇體質量大一些的成年小鼠。本課題組同時對大鼠肝剪切波速檢測發現，3～4周齡正常大鼠肝臟因體積小而受管道干擾，其檢測到的肝剪切波速竟高于6月齡大鼠。大齡大鼠因肝臟體積大，如選擇檢測部位不同其所含管道密度也不同，肝剪切波速相差很大，這一現象也似表明：與其說反映肝剪切波速增齡性變化不太明顯， 不如說其含管道密度影響肝剪切波速檢測結果（將另文發表）。小動物B超如富士 VisualSonics 公司VEVO系列2100、3100，特別是最新升級版的多模式光聲成像系統LazrX，因其高分辨率（30～40 MHz甚至70 MHz），適合包括斑馬魚、小鼠在內的更小動物的急性肝炎和肝纖維化等慢性肝損傷的檢測[17]。事實上，同時應用多模式光聲成像系統LazrX的光聲儀檢測含氧與非含氧血紅蛋白以分析肝內血氧飽和度時發現，急性肝損傷時肝內灌流不足導致嚴重缺氧，保肝有效藥物可明顯恢復肝內血氧供應，而CCl4等肝損傷藥物明顯加重了肝內缺血缺氧（結果待發表）。

綜上所述，本研究結果表明，采用ARFI法進行肝剪切波速檢測能反映小鼠肝纖維化變化，但炎性細胞浸潤也導致肝剪切波速變化，因此須排除肝內炎性細胞浸潤所致肝損傷對肝內剪切波速的影響。