不同低氧脅迫方式構建SD大鼠高原肺水腫模型的比較研究

林 雪，雷有芳，蒲小燕

（青海大學醫學院基礎醫學部，西寧 810016）

高原肺水腫（high altitude pulmomary edema，HAPE）是指機體快速（24～72 h內）暴露于高原低氧環境后，急性缺氧導致肺毛細血管內皮細胞和肺泡上皮細胞受損，通透性增加，進而產生以肺間質或肺泡水腫為基本病理特征的急性高原疾病，臨床表現為心慌、胸悶、咳嗽、呼吸困難、咳粉紅色泡沫痰、肺部濕啰音和發紺等，該病危害性大，嚴重時可危及生命[1-2]。由于HAPE的發病機制復雜，目前其發病原因仍不清楚[3-4]，可能與海拔高度、環境溫度、運動強度及機體的適應與重塑有關[5-6]，但至今仍無一種制作HAPE模型的標準方法。因此，本課題組通過不同的低氧脅迫方式構建重現性較高的HAPE大鼠模型，為后期的疾病研究創造基礎條件。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及模型構建

SPF級雄性SD大鼠60只，體質量200±2 0 g，購自西安交通大學醫學部實驗動物中心[SCXK（陜）2019-0001]。所有大鼠隨機分為3組：（1）對照組，飼養于四川大學華西醫院科技園區科研基地動物實驗樓（海拔4 0 0 m）[SYXK（川）2018-119]；（2）低壓氧艙組，于青海大學醫學院高原醫學研究中心低壓氧艙室，先模擬海拔6 000 m低氧脅迫48 h后，立即降至3 500 m進行動物實驗；（3）實地低氧組，于青海省瑪多縣人民醫院（海拔4 200 m）低氧脅迫28 d后，立即進行動物實驗。每組20只。實驗期間，3組動物的飼養環境均達到如下要求：SPF環境飼養，溫度為20～26 ℃，相對濕度為40%～70%，自由進食飲水（飲水瓶的瓶口加鋼珠）。所有大鼠用45 mg/kg戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉，取仰臥位固定于實驗臺，手術部位備皮消毒，待大鼠無角膜反射及收縮反應后，進行下述實驗操作。實驗中所涉及處理動物的操作均按照國家相關法規要求執行。

1.2 血氣及血管組織病理檢測

切開大鼠腹部皮膚及肌肉層，暴露腹腔背側面，分離腹主動脈，用PresetBM動脈采血器（美國BD公司產品）抽取全血1 mL，通過Sysmex全自動血氣分析儀分析腹主動脈血氧分壓及氧飽和度；分離右頸外靜脈，結扎遠心端，用動脈夾夾住近心端，挑起頸外靜脈，氣管插管行機械通氣后，使用PowerLab生理記錄儀觀察壓力波形的變化。將導管緩慢插入上腔靜脈到右心房，可見小的壓力波形，繼續將導管插入右心室，記錄右心室壓力曲線。再將導管在右心室血流的作用下送入肺動脈，通過壓力傳感器采集肺動脈壓力，并記錄數據。

1.3 肺組織含水量測定

以斷頸法迅速處死大鼠后，取左肺上葉，用吸水紙吸去組織表面水分，電子天平稱濕重，記為W1；恒溫烘干箱55 ℃烤72 h至恒重，稱干重，記為W2。根據Elliot公式計算肺組織含水量＝（W1－W2）/W1×100%。

1.4 肺組織HE染色后顯微結構檢測

以斷頸法處死大鼠后，取右肺下葉組織，大小5 mm×5 mm×5 mm，漂洗后用4%多聚甲醛溶液（編號BL539A，日本TaKaRa公司產品）固定。常規石蠟包埋，制成5 μm厚的石蠟切片后，用HE染色試劑盒染色（編號G1120，日本TaKaRa公司產品），光學顯微鏡（型號CX-21，日本Olympus公司產品）放大400倍后觀察各組大鼠肺組織的形態結構變化。

1.5 肺組織超微結構檢測

取右下肺尖處肺組織，切成1 mm3小塊，固定于2.5%戊二醛溶液即Gluta固定液（編號P1126，日本TaKaRa公司產品）中，按常規制作電鏡超薄切片，用透射電鏡（型號JEM-1400PLUS，日本電子株式會社產品）觀察各組大鼠肺組織的超微結構改變。

1.6 肺組織氧化應激相關蛋白檢測

取左肺下葉肺組織，加入一定量的PBS手動勻漿，取勻漿液于低溫離心機中3000 r/min離心20 min。取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司產品）操作說明，檢測谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，G S H-P x）、超氧化物歧化酶（s u p e r o x i d e dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，用酶標儀檢測各孔吸光度，最后計算出目的蛋白濃度。

1.7 實時熒光定量PCR檢測關鍵基因表達

使用TRIzol（編號N0.9769，日本TaKaRa公司產品）提取左肺下葉肺組織總RNA，反轉錄成cDNA，然后采用實時熒光定量PCR法檢測組織中水通道蛋白1（aquaporin-1，AQP-1）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達情況。按照Real-time Quality PCR試劑盒說明書進行操作，用實時熒光定量儀（美國ThermoFisher公司產品）對樣品進行檢測。引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以β-actin作內參，采用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達值。各個基因的表達值測量均重復3次。

1.8 蛋白質印跡法檢測關鍵蛋白表達

細胞總蛋白提取：用冷的PBS洗肺組織3

表 1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

次，濾紙吸去水分，置于液氮中研磨至粉末狀，加入RIPA裂解液，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，上清液即為細胞總蛋白。根據所測定蛋白質的質量濃度（μg/μL），計算所要上樣的體積（μL），將樣品加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，100 ℃加熱變性，上樣后進行SDS-PAGE（80 V 30 min，120 V 60 min）。電泳結束后，切下需要的凝膠條帶，加入事先預冷的2×Transfer Buffer，冰盒內電轉膜（200 mA 90 min）。用含5% BSA的封閉液進行封閉，加入1∶500稀釋的兔抗人VEGF多克隆抗體（編號SP0810，廣州深達生物有限公司產品）和兔抗人AQP-1多克隆抗體（編號P4788Rb-h，上海萬疆生物有限公司產品），4℃孵育過夜；隨后加入1∶10 000稀釋的熒光標記的羊抗兔IgG（編號BA1054，武漢博士德生物工程有限公司產品），室溫避光孵育1 h，用Licor Odyssey紅外成像系統掃描實驗結果，最后運用Quantity One軟件分析目的條帶與β-actin蛋白條帶的灰度值之比。

1.9 統計學分析

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據處理。數據的正態性和方差同質性采用Kolmogoroe-Simirnov和Levene檢驗，符合正態分布并具有同質性的數據均以x-±s表示。3組比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠肺動脈壓及血氧值分析

與對照組相比，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠的肺動脈壓顯著升高（均P＜0.01），而氧分壓及氧飽和度均顯著下降（均P＜0.01）；此外，肺動脈壓、氧分壓及氧飽和度在低壓氧艙組和實地低氧組之間比較，均顯示無明顯差異（P＞0.0 5），見圖1。

2.2 肺組織含水量分析

與對照組相比，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠的肺組織含水量均明顯升高（每組6只，肺組織含水量分別為0.720±0.007、0.799±0.004和0.7 92±0.0 09），差異具有統計學意義（均P＜0.01）；此外，肺組織含水量在低壓氧艙組和實地低氧組之間比較，均顯示無明顯差異（P＞0.05）。

圖 1 各組大鼠的肺動脈壓、腹主動脈血氧飽和度及動脈血氧分壓Figure 1 Pulmonary arterial pressure, abdominal aortic oxygen saturation and arterial partial pressure of oxygen of rats in each group

2.3 肺組織形態學變化

HE染色后，對照組大鼠的肺組織形態在光鏡和電鏡下均顯示結構正常：光鏡下，肺泡腔結構清晰，肺泡間隔無大量紅細胞，并未出現水腫現象；電鏡下，肺泡結構完整，未出現間質水腫。低壓氧艙組和實地低氧組大鼠的肺組織水腫十分嚴重：光鏡下，兩組肺組織均可見肺泡間隔明顯增寬，大量紅細胞和炎性細胞溢出；電鏡下，兩組大鼠均出現肺泡間隔明顯水腫，見圖2。

2.4 肺氧化應激水平分析

ELISA檢測結果顯示，與正常對照組相比，低壓氧艙組及實地低氧組大鼠肺組織中SOD活力和GSH-Px含量均明顯降低，MDA濃度明顯升高，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。此外，SOD、MDA和GSH-Px在低壓氧艙組和實地低氧組之間比較，均顯示無明顯差異（P＞0.0 5），見表2。

圖 2 各組大鼠肺組織的光鏡和電鏡觀察結果Figure 2 Light and electron microscopic results of rat lung tissues in each group

表 2 各組大鼠肺組織氧化應激水平Table 2 Oxidative stress levels in lung tissues of rats in each group(± s)

表 2 各組大鼠肺組織氧化應激水平Table 2 Oxidative stress levels in lung tissues of rats in each group(± s)

注：與對照組相比，**P<0.0 1。

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2.5 肺組織中VEGF及AQP-1表達

實時熒光定量PCR（圖3A）和蛋白質印跡法（圖3 B）檢測結果顯示，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠肺組織中AQP-1 mRNA和蛋白表達水平均較對照組明顯升高，差異有統計學意義（均P＜0.01），而VEGF mRNA和蛋白表達水平均較對照組明顯降低，差異有統計學意義（均P＜0.01）。

圖 3 各組大鼠肺組織中VEGF和AQP-1 mRNA（A）及蛋白（B）的表達量分析Figure 3 The expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and aquaporin-1 (AQP-1) at the levels of mRNA (A)and protein (B)

3 討論

HAPE作為一種非心源性肺水腫，是由于機體快速進入高海拔地區后對低壓低氧環境不適應而產生的一種高原地區特發性疾病[7]。國內外多采用模擬高原低氧環境復制HAPE大鼠模型，通過觀察大鼠行為活動、疾病的發生過程及相應病理變化，以確定高原艙模擬的HAPE大鼠模型成功建立。由于高原艙模擬的HAPE大鼠模型的成功建立需要達到相應的評判標準，并受到海拔高度、減壓速度及持續時間、艙內環境和機體情況等多種因素影響，所以理想的動物模型建立除了能夠復制疾病的發生、發展過程及相應病理變化外，還應該滿足操作簡便、因地制宜、人力及物力消耗少等條件[8]。本實驗在既往HAPE動物模型復制（低壓氧艙環境模擬海拔6 000 m）的研究基礎上，還在實地低氧環境（青海省瑪多縣海拔4 200 m）下構建了HAPE動物模型，然后比較兩組HAPE大鼠模型肺組織的干濕比、顯微結構、超微結構、部分血氧值、肺動脈壓力、關鍵基因（AQP-1及VEG F）表達及氧化應激對應指標的差異，證明了兩種造模方法均能成功構建HAPE模型。

本實驗通過肺組織的HE染色發現，相較于正常對照組，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠均表現出嚴重的肺組織水腫現象，兩組肺組織肺泡間隔明顯增寬，大量紅細胞和炎性細胞溢出，且出現肺泡間隔的明顯水腫，這一結果說明在低氧刺激下，肺毛細血管通透性增加，大量液體通過靠近阻力血管的動脈壁漏出、轉移并潴留，引起肺間質和肺泡水腫，推測兩組SD大鼠HAPE模型構建成功。此外，在本實驗中，低壓氧艙組和實地低氧組均表現為顯著的肺動脈高壓，而腹主動脈血氧分壓及氧飽和度均明顯下降，這是由于大鼠進入急性低氧環境后，對環境的習服適應機制尚未建立，從而產生一系列應激反應，持續的應激反應使肺血管直接或間接收縮、阻力增大，導致肺動脈壓力升高，從而引起血氧分壓及氧飽和度下降[9]。

國內外大量研究表明，肺臟干濕重比的測定是評估肺水腫動物模型效果的最佳方法[10]。本實驗采用該方法評價低氧脅迫方式構建的大鼠HAPE模型，結果顯示，兩組模型中（W1－W2）/W1比值升高，符合肺水腫后肺組織的病變特征。有研究表明，VEGF與其特異性受體結合后能夠提高血管通透性，且AQP-1與水和蛋白的漏出密切相關[11]。因此，本實驗通過實時熒光定量PCR和蛋白質印跡法檢測了肺組織中VEGF及AQP-1的表達，發現低壓氧艙組和實地低氧組肺組織內VEGF表達水平均異常升高，超出機體的代償能力，而兩個模型組大鼠肺組織中AQP-1表達水平均顯著下降。結合以往文獻推測，VEGF使肺毛細血管通透性增加，導致大量血漿蛋白漏出血管外[12]；而AQP-1使肺泡主動轉運液體功能及細胞膜水通透功能異常，出現了水抑制[13]，進而出現了肺水腫現象。現在的研究認為，SOD是機體內主要的抗氧化酶[14]；而MDA作為脂質過氧化反應的最終產物，是機體內反映氧化損傷程度最經典、最有效的指標之一[15]。此外，GSH是一種能夠直接清除ROS、保護細胞免受自由基損害的內源性抗氧化劑。本實驗結果顯示，低壓氧艙組和實地低氧組大鼠肺組織中SOD和GSH-Px含量均顯著低于對照組，說明低氧脅迫后大鼠抗氧化能力下降，機體受到氧化應激損傷；此外這兩組大鼠肺組織中MDA濃度明顯高于對照組，說明HAPE啟動了脂質過氧化反應，提高了脂質過氧化物含量，從而加重了肺損傷。

綜上所述，本研究對比了兩種造模方法，發現不同低氧脅迫方式均能構建SD大鼠HAPE模型，且可安全、便捷地觀察其病理變化過程。另外，本實驗初次在實地低氧環境中建立適合高海拔地區的、簡單有效且可復制的大鼠H A P E實驗模型，為在高原地區進一步研究HAPE發病機制并預防和診治該疾病提供了動物實驗基礎，具有重要意義。