香葉木素對胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷的作用及其機制探討

郝莉霞，盧 蓉，馬霞霞，樊書娟

(1. 延安大學附屬醫院新生兒科，延安716000；2. 延安大學附屬醫院兒科一病區，延安716000；3. 西安交通大學第一附屬醫院新生兒科，西安 710061)

胎糞吸入性肺炎（meconium aspiration pneumonia）又稱胎糞吸入綜合征，是引起新生兒呼吸窘迫綜合征的原因之一，尤其在足月或過期妊娠嬰兒中發病率和死亡率極高[1]。在分娩過程中，胎糞沿著呼吸道進入肺泡引起機械性阻塞和化學炎性反應，同時引起其他器官損傷[2]。胎糞吸入性肺炎占所有呼吸衰竭病例的10%左右，在發展中國家的死亡率約為39%，早期診斷和早期治療對改善患者預后很重要[3]。目前尚無有效的藥物干預措施用于降低胎糞吸入性肺炎死亡率，因此迫切需要開發新的有效的預防和治療方法。

香木葉素是一種從橄欖葉和豆科植物中分離出來的黃酮類化合物，具有抗炎、抗雌激素、抗氧化劑、抗微生物和抗腫瘤等藥理作用[4]。已有研究報道，香木葉素可通過激活核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路和抑制含pyrin結構域的NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor with pyrin domain 3，NLRP3）炎癥小體，減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷[5]，說明香木葉素對肺損傷有治療作用。然而目前尚未見有相關文獻報道香葉木素對胎糞吸入性肺炎的作用機制。本研究用胎糞誘導建立大鼠急性肺損傷模型，探討香葉木素對胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷的作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑

香葉木素（批號111788-200801）購自中國食品藥品檢定研究院，化學式為C16H12O6，相對分子質量為300.3，純度≥95.7%；甲強龍（CAS號2375-03-3）購自美國TargetMol公司；HE染色試劑盒（貨號C0105）購自上海碧云天生物技術研究所；兔抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（ab6671）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）（ab100704）、IL-6（ab100712）、NLRP3（ab214185）、剪切型半胱天冬酶1（cleaved caspase-1，c-caspase-1）（ab138483）和GAPDH單克隆抗體（ab9485）均購自英國Abcam公司。

1.2 動物模型的建立與分組

50只1日齡SPF級雄性SD大鼠購自空軍軍醫大學（原第四軍醫大學）實驗動物中心[SCXK（陜）2014-002]，飼養于陜西省食品藥品檢驗研究院[SYXK（陜）2018-002]，室溫23～25 ℃，光照/黑暗時間12 h/12 h，自由進食飼料和水。用氯胺酮（20 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，行氣管切開術。取48只大鼠隨機分為4組，每組12只，按下述方法操作[6]。手術對照組：將大鼠置于機械通氣機上，氣管中插入氣管導管，呼吸機通氣30 min，緩慢注入0.9%氯化鈉溶液即生理鹽水（1.5 mL/kg），呼吸機通氣15 min，確保生理鹽水均勻進入支氣管及肺泡，縫合切口。模型組：將大鼠置于機械通氣機上，氣管中插入氣管導管，呼吸機通氣30 min，緩慢注入胎糞（1.5 mL/kg），呼吸機通氣15 min，確保胎糞均勻進入支氣管及肺泡，縫合切口。甲強龍組：操作同模型組，模型建立后尾靜脈注射甲強龍（2 mg/kg），作為陽性對照。香葉木素組：操作同模型組，模型建立后腹腔注射香葉木素（20 mg/kg）。造模過程中，對照組大鼠死亡1只，模型組大鼠死亡4只，甲強龍組和香葉木素組大鼠各死亡2只。模型組補充2只大鼠，以同樣實驗方法造模并成功，最終各組大鼠均取10只用于后續實驗。

各組處理24 h后麻醉，開胸，心臟放血法處死大鼠。解剖后，取各組大鼠肺組織，稱重，然后用體積分數為10%的甲醛溶液固定，行石蠟包埋切片。

1.3 動脈氧合指數

建模后24 h，處死前取各組大鼠動脈血，加入全自動血氣分析儀，檢測動脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PaO2）和吸入氧分數（fraction of inspired oxygen，FiO2），根據公式計算動脈氧合指數：氧合指數＝ PaO2/FiO2。

1.4 HE染色

采用HE染色方法進行肺組織病理學檢測。將石蠟切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，蘇木精染色細胞核5 min，水洗5 s，伊紅染色細胞質30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封固，在熒光顯微鏡下觀測染色結果。參考Turhan等[7]的方法，計算肺損傷病理評分。

1.5 酶聯免疫吸附測定法檢測IL-6、IL-1β和TNF-α含量

模型建立24 h后，采用支氣管肺泡灌洗術[8]收集肺泡表面液體，在4 ℃下用50 mmol/L碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原后，以100 μL/孔的量接種到96孔酶標板。按照試劑盒說明進行IL-6、IL-1β和TNF-α含量檢測，用酶標儀測定450 nm處吸光度，通過繪制標準曲線求出樣品中I L-6、IL-1β和TNF-α含量

1.6 蛋白質印跡法檢測NLR P3、IL-1β和c-caspase-1蛋白表達

將肺組織置于玻璃勻漿器內，在冰上溶解25 min。以12 000 r/min的速度離心10 min，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，用BCA試劑盒測定蛋白質含量。取等量的蛋白質樣品（20 mg），在100℃條件下變性5 min。然后采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，電泳結束后將蛋白條帶轉移至聚偏二氟乙烯膜，在4 ℃條件下加入兔抗NLRP3、IL-1β和c-caspase-1單克隆抗體（工作液稀釋比例均為1∶1 000），并孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液清洗，然后在4 ℃下加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶20 000）并孵育2 h，最后加入電化學發光染色液，曝光處理。應用Image J軟件統計各條帶灰度值，以分析目的蛋白的相對表達水平。

1.7 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件對各實驗結果進行統計學分析。計量數據用x-±s表示，組間比較采用多因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 香葉木素降低動脈氧合指數

與對照組比較，胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷模型組平均動脈氧合指數明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。而與模型組相比，甲強龍組（即陽性藥物對照）的平均動脈氧合指數明顯降低（P＜0.01），香葉木素組的平均動脈氧合指數也低于模型組（P＜0.05），但比甲強龍組有所回升（6.10±0.96vs19.60±2.04）（圖1）。

圖 1 香葉木素對胎糞誘導的急性肺損傷大鼠動脈氧合指數的影響Figure 1 Effect of diosmetin on the arterial oxygenation index in rats with meconium-induced acute lung injury

2.2 香葉木素下調炎性因子IL-6、IL-1β和TNFα水平

與對照組相比，胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷模型組大鼠的IL-6水平明顯升高（P＜0.01），而甲強龍組和香葉木素組的IL-6水平均明顯低于模型組（均P＜0.01）；模型組的IL-1β水平明顯高于對照組（P＜0.01），而甲強龍組和香葉木素組的IL-1β水平明顯低于模型組（均P＜0.01）；與對照組相比，模型組的TNF-β水平也明顯升高（P＜0.01），而甲強龍組和香葉木素組的TNF-α水平也明顯低于模型組（均P＜0.01）（圖2）。

圖 2 香葉木素對胎糞誘導急性肺損傷大鼠中炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響Figure 2 Effects of diosmetin on the levels of inflammatory cytokines IL-6, IL-1β, and TNF-α in rats with meconium-induced acute lung injury

2.3 香葉木素減輕肺組織病理損傷程度

HE染色檢測各組大鼠肺組織病理損傷情況，結果如圖3A所示。對照組肺泡擴張良好，支氣管黏膜正常。與對照組相比，胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷模型組表現出明顯的病理損傷，肺泡壁明顯水腫，肺實質明顯實變，管腔狹窄，可見大量炎性細胞浸潤，肺損傷評分明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，甲強龍組的肺泡壁仍水腫、增厚，但炎性細胞浸潤減少，肺組織評分明顯降低（P＜0.05）。香葉木素組較模型組的肺組織病理損傷程度明顯降低，肺泡壁輕微水腫，中度出血及炎性細胞浸潤，肺組織評分明顯降低（P＜0.0 5，圖3 B）。

模型建立12 h后稱肺組織質量，結果如圖3C所示：模型組的肺質量明顯高于對照組（P＜0.01），而甲強龍組和香葉木素組的肺質量明顯低于模型組（均P＜0.0 1）。

2.4 香葉木素下調NLRP3、c-caspase-1和IL-1β蛋白表達

蛋白質印跡法檢測各組大鼠肺組織中NLRP3、IL-1β和c-caspase-1蛋白水平，結果如圖4所示。與對照組相比，胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷模型組的NLRP3蛋白水平明顯升高（P＜0.01），而甲強龍組和香葉木素組的NLRP3蛋白水平均明顯低于模型組（均P＜0.01）；模型組的c-caspase-1蛋白水平也明顯高于對照組，甲強龍組和香葉木素組的c-caspase-1蛋白水平也明顯低于模型組（均P＜0.01）；模型組的IL-1β蛋白水平明顯高于對照組、甲強龍組和香葉木素組（均P＜0.01）。

圖 3 香葉木素對胎糞誘導急性肺損傷大鼠的肺組織病理損傷程度的影響Figure 3 Effect of diosmetin on the pathological degree of lung tissues in rats with meconium-induced acute lung injury

圖 4 香葉木素對胎糞誘導急性肺損傷大鼠中NLRP3、c-caspase-1和IL-1β蛋白水平的影響Figure 4 Effects of diosmetin on NLRP3, c-caspase-1 and IL-1β levels in rats with meconium-induced acute lung injury

3 討論

胎糞吸入性肺炎是一種胎糞引起的新生兒呼吸功能障礙，能導致嚴重的肺功能衰竭。臨床上，胎兒窘迫或子宮內抽吸導致胎糞吸入，從而發生炎性反應、氣道阻塞、肺表面活性物質失活及細胞凋亡，從而破壞肺發育[9-10]。目前，胎糞吸入性肺炎的確切機制在很大程度上仍不清楚，治療僅局限于機械通氣、表面活性劑治療和氣道清潔[11]。因此，治療胎糞吸入性肺炎想要取得良好的效果，需要探索新的有效藥物。

香葉木素天然存在于豆科植物金合歡和橄欖葉的葉子中。已經證實香葉木素具有多種藥性，包括抗菌、抗癌、抗炎和抗氧化活性[12]。傳統醫學植物成分作為胎糞吸入性肺炎的預防和治療藥物正越來越受到人們的關注[13]。組織病理學變化是胎糞吸入性肺炎的可視化反應，本實驗通過HE染色觀察發現香葉木素改善了胎糞誘導的肺組織病理學癥狀，如炎性細胞浸潤和肺泡充血均減輕，肺損傷評分降低。此外，香葉木素明顯減輕了胎糞誘導的新生大鼠肺組織質量。

胎糞吸入性肺炎患兒由于呼吸功能較差，肺部換氣及通氣功能受阻，導致機體氧供不足，引起血氣指標發生相應的異常變化[14]。血氣分析能夠反映組織氧供及耗氧狀態。Chen等[2]研究發現，高頻振蕩通氣聯合肺表面活性物質表達通過降低動脈氧合指數對胎糞吸入性肺炎具有顯著療效。本實驗結果顯示，香葉木素降低了新生大鼠胎糞吸入性肺炎的動脈氧合指數，表明香葉木素通過改善血氣狀態，對胎糞誘導新生大鼠的呼吸功能進行調節。

胎糞是水、上皮細胞、膽汁、黏液和羊水的復雜混合物，含有多種可能引起炎性反應的危險因子[15]。炎性反應已被證明在胎糞誘導的肺損傷中發揮了關鍵作用[16]。胎糞是中性粒細胞和肺泡巨噬細胞的有效激活劑。在胎糞吸入性肺炎的早期階段，IL-1β是一種相當活躍的細胞因子，可引起促炎介質如IL-6和IL-8釋放，從這些介質中獲取支持，募集炎性細胞，過度炎性反應最終導致肺損傷[17]。香葉木素可以改善促炎性細胞因子的產生，如TNF-α、IL-1β和IL-6[18]。Thomas等[19]研究發現，C5和CD14聯合抑制體內胎糞誘導的炎性因子IL-6和IL-1β表達，從而治療胎糞吸入性肺炎。Zhang等[20]研究發現，香葉木素顯著降低了細菌性腦膜炎大鼠模型的海馬組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平。本實驗結果與上述研究結果一致，香葉木素極顯著地降低支氣管肺泡中炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α分泌水平，同時降低了肺組織中IL-1β蛋白表達水平，表明香葉木素通過調節炎性因子水平改善胎糞誘導的新生大鼠肺損傷。

NLRP3炎性小體作為固有免疫的重要組分，在機體免疫反應和疾病發生過程中具有重要作用。NLRP3炎性小體由NOD樣受體蛋白家族成員凋亡相關斑點樣蛋白和caspase-1組成，可以通過各種刺激激活細菌、病毒、真菌和垂死細胞的重要成分[21]。蛋白酶caspase-1介導細胞因子IL-1β和IL-18，刺激促炎免疫應答，并保護生物體免于病原體誘導的死亡[22]。已有研究表明，NLRP3炎性小體過度激活釋放炎性介質，導致與肺部疾病相關的炎性反應[23]。Liu等[5]研究發現，香葉木素通過激活Nrf2通路，抑制NLRP3炎性小體，減輕脂多糖誘導的急性肺損傷。Zhang等[24]研究發現，褪黑素通過抑制NLRP3和c-caspase-1蛋白表達治療急性肺損傷。本實驗結果與上述研究結果一致，香葉木素下調胎糞誘導的急性肺損傷中NLRP3、c-caspase-1和IL-1β蛋白水平，提示NLRP3炎癥小體可能與胎糞誘導的新生大鼠急性肺損傷病情嚴重程度以及病程有關，可以作為評估其疾病進程的一個指標。

綜上所述，香葉木素改善新生大鼠炎性反應、呼吸狀況及病理損傷的效果較好，可將香葉木素用于治療新生兒胎糞吸入性肺炎。本實驗尚存在一定局限性，如納入樣本少，指標單一，還需配合機械通氣治療，因此香葉木素治療胎糞吸入性肺炎的安全性和有效性仍需要進一步的臨床試驗加以探究和證實。