眼缺血綜合征大鼠視網膜形態及RhoA和ROCK-2表達的變化

安 鑫，劉蘭靜，步建平

(首都醫科大學大興教學醫院眼科，北京 102600)

眼缺血綜合征（ocular ischemic syndrome，OIS）是一類累及眼部及腦部等器官的多學科的疾病，患者通常可伴有頸動脈不同程度的狹窄及阻塞[1]。由于該病起病隱匿，早期診斷困難，后期嚴重損害患者視力，甚至致盲，所以對OIS發病機制的研究尤為重要。目前研究已證實，利用雙側頸總動脈完全結扎（BCCAO）法不僅可以制作慢性腦缺血的動物模型；同時因為BCCAO可導致視網膜慢性缺血而被嘗試作為OIS建模方法[2]。Rho（Ras-related monomer guanosine triphosphate kinase）/ Rho激酶信號通路與鈉/鉀/鈣離子信號通路一樣，體內分布廣泛，通過介導細胞凋亡、細胞增殖和細胞收縮等參與機體多種生理及病理過程。研究表明Rho/Rho激酶通路對于視網膜缺血再灌注、急性視網膜缺血等發揮重要作用[3-4]，但是在視網膜慢性缺血如OIS中的作用鮮有報道。有學者在BCCAO導致慢性腦缺血的動物模型中發現，腦缺血后腦皮質及海馬RhoA、ROCK-2（Rho-associated coiled coil forming protein kinase-2）表達增加[5]；由于視網膜組織及血管與腦部構造高度相似，推測在眼部慢性缺血，尤其是OIS中可能也存在同樣的改變。本實驗將初步探索OIS模型與RhoA、ROCK-2表達的關系，從而為臨床診治OIS提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級近交系雄性BN大鼠20只，2～3月齡，250～300 g，購自北京維通利華公司[ SCXK（京）2016-0006]。大鼠飼養于18～25 ℃室溫環境，相對濕度50%～70%[SYXK(京)2017-0019]，自由飲食。

1.2 動物模型的建立

20只大鼠采用抽簽隨機法分為2組，每組10只。OIS模型組大鼠采用BCCAO法造模[6]；假手術組中只游離大鼠雙側頸總動脈，其余處理同模型組。兩組大鼠術后自由飲食，常規消毒頸部傷口，未使用鎮痛藥及抗生素。

1.3 組織學觀察

術后3個月將大鼠脫頸椎處死，取大鼠雙側眼球置于質量分數4% 的多聚甲醛溶液中固定24 h，依次經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明和組織浸蠟，將眼球包埋成石蠟包塊。按照平行于視盤至角膜的矢狀位平面縱向切片（厚度為7μm），HE染色后在光學顯微鏡下觀察并拍照。選擇100倍視野下觀察2組大鼠眼球視網膜神經節細胞層（ganglion cell layer，GCL）5個不同區域中神經節細胞數，應用Image-Pro Plus 5.0 軟件觀察距視盤邊緣200 μm處的視網膜厚度，分別測量視網膜總厚度（total retina thickness, TRT）以及外核層（outer nuclear layers, ONL）、外叢狀層（outer plexiform layer, OPL）、內核層（inner nuclear layer, INL）和內叢狀層（inner plexiform layer, IPL）厚度（μm），每個樣本測量5次，取其平均值。

1.4 免疫組織化學法測定RhoA和ROCK-2蛋白在視網膜中的表達

石蠟切片脫蠟脫水。按照常規組織化學方法及試劑盒說明分別進行RhoA和ROCK-2免疫組織化學檢測，用PBS代替一抗作陰性對照，顯色劑顯色，自來水充分沖洗，對比染核及封固。在高倍鏡下隨機選取5個視野觀察陽性細胞，即細胞質中有棕黃色顆粒者。采用Image-Pro Plus 5.0軟件測量平均吸光度。

1.5 蛋白質印跡法檢測RhoA和ROCK-2蛋白表達量

摘取麻醉大鼠雙眼眼球并提取視網膜組織，將其放入－80℃冰箱中保存。取視網膜組織加入裂解液，離心并提取視網膜組織蛋白，用Lowry法測定蛋白濃度。取總蛋白20 μL，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，進行蛋白質轉膜，加入抗體顯色，采用UVP凝膠數字成像系統將β-actin表達量作為內參進行結果分析，用Image-Pro Plus 5.0軟件測定灰度值，目的蛋白的表達水平按照目的蛋白條帶和內參條帶的比值計算。

1.6 統計學處理

統計學分析采用SPSS 18.0軟件進行，計量資料以x-±s表示；采用兩獨立樣本的t檢驗進行計量資料分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模術后情況

造模當日OIS模型組中1只大鼠死亡，可能與手術中出血較多、代償能力差有關。其余大鼠正常存活，飲食、飲水及活動正常。

2.2 大鼠視網膜組織學觀察

由視網膜HE染色切片觀察，OIS模型組大鼠視網膜神經節細胞數量（圖1A）較假手術組（圖1B）明顯減少；分別計算兩組神經節細胞單位面積密度，結果與所觀察一致，與假手術組神經節細胞數量（819.9±311.0）相比，OIS模型組（280.2±78.0）顯著降低（P＜0.01）。兩組大鼠視網膜厚度測量結果顯示，與假手術組相比，OIS模型組TRT明顯減?。≒＜0.05），OIS模型組INL、IPL及OPL厚度與TRT變化一致，均明顯變?。ň鵓≤ 0.01），ONL相對變薄，但差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

2.3 視網膜中RhoA和ROCK-2的分布及表達

免疫組織化學法檢測發現，RhoA和ROCK-2蛋白主要集中表達在神經節細胞層胞質、IPL、INL和OPL中（圖2）；假手術組大鼠視網膜可觀察到少量RhoA和ROCK-2表達；與假手術組相比，OIS模型組視網膜中RhoA蛋白表達水平升高（P＜0.05），ROCK-2蛋白表達水平增高（P＜0.05）（表2）。

蛋白質印跡法檢測結果顯示，在2組大鼠視網膜組織蛋白樣本量及內參照β-actin 條帶灰度基本相同的前提下，與假手術組RhoA蛋白（1.27±0.23）相比，OIS模型組RhoA蛋白表達水平（2.41±0.38）顯著升高（P＜0.01）；同時OIS模型組ROCK-2蛋白表達水平（0.40±0.08）高于假手術組（0.25±0.05）（P＜0.05）（圖3）。

圖 1 各組大鼠視網膜組織學觀察 (HE染色)Figure 1 Histological observation on retina of rats in OIS model group and the sham group (HE staining)

表 1 各組大鼠各層視網膜厚度比較Table 1 Retinal thickness of rats in OIS model group and the sham group(厚度/μm, -x ± s)

圖2 免疫組織化學法觀察各組大鼠視網膜RhoA、ROCK-2的表達Figure 2 Immunohistochemical assay of RhoA and ROCK-2 in retinal tissues of rats in the OIS model group and the sham group

表 2 免疫組織化學法檢測大鼠視網膜中RhoA和ROCK2蛋白表達Table 2 Expressions of RhoA and ROCK-2 proteins in rat retina detected by immunohistochemical assay(-x ± s)

圖 3 蛋白質印跡法檢測各組大鼠視網膜中RhoA和ROCK-2表達Figure 3 Expressions of RhoA and ROCK-2 proteins in retina of rats detected by Western blotting

3 討論

采用BCCAO法研究眼部缺血性病變，尤其是OIS，已得到越來越多的認可[7]。雙側頸總動脈被結扎后，眼動脈進一步缺血，但可以通過椎動脈等代償性供血，從而導致眼部局部缺血，所以BCCAO法導致的眼部組織及功能損傷過程與OIS極為相似[8]。頸總動脈結扎后，眼球局部缺血加速神經節細胞及光感受器變性，從而進一步引起感覺傳入神經阻滯和視神經束變性，最終導致瞳孔反射消失[6,9]。

本研究發現，BCCAO術后神經節細胞明顯減少，同時內層視網膜即內叢狀層厚度變薄顯著。Yamamoto 等[10]發現，術后1周神經節細胞減少40%～60%。眼部缺血后內層視網膜最為敏感，其主要原因為BCCAO術后眼部血供減少，為內層網膜供血的視網膜中央動脈進一步缺血缺氧，加之其為終末動脈且無側枝循環，最終加速視網膜神經節細胞數量減少及各種其他細胞的凋亡，視網膜萎縮變薄。本研究結果顯示，BCCAO術后90 d除ONL外各層網膜變薄。Yamamoto等[10]研究也發現BCCAO術后2周即可觀察到INL退行性改變，與本實驗結果相符。但Daniel等[8]在術后1個月只觀察到IPL損傷，其他層改變無統計學意義，延遲損害的原因可能是由于大鼠血管的先天性異常及麻醉藥物的不同。本實驗中發現ONL相對變薄，但差異無統計學意義，可能原因為外層視網膜的血供主要來源于脈絡膜，脈絡膜的血供主要來源于睫狀后短動脈，且側枝循環豐富，彼此交通，故外層視網膜往往損傷較小。但是Davidson 等[11]和Stevens 等[12]研究結果與本研究結果相反，大鼠BCCAO術后視網膜ONL厚度明顯減少，可能原因是術后脈絡膜急性缺血，從而導致外層視網膜急性缺血。

Rho/Rho激酶信號通路包括Rho、Rho激酶（ROCK）和肌球蛋白磷酸酶（myosin phosphatase，MP）。其中RhoA 是目前研究最多的Rho蛋白[13]。ROCK分為ROCK-1和ROCK-2，是Rho的下游靶效應分子中最主要的效應分子；前者主要分布于非神經組織中，如骨骼肌等；后者主要分布于心臟和中樞神經系統[14]。被激活的ROCK作用于MP，使肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）增加或減少磷酸化水平，從而誘導細胞的收縮和舒張，產生相應的生物學行為[15]。近年來研究發現，RhoA/ROCK通路在心、腦、肺等多個器官的慢性缺血性疾病中發揮作用[16-18]。本研究中OIS模型組RhoA 和ROCK-2表達顯著增高，提示BCCAO導致的慢性視網膜缺血狀態進一步激活了Rho/ROCK信號通路，從而使RhoA及ROCK-2表達增加。Du等[19]研究發現，BCCAO術后3個月視網膜中RhoA 表達顯著增高，與本實驗結果一致。RhoA 及ROCK-2表達增加可能是由于視網膜慢性缺血缺氧后，炎性因子釋放以及血-視網膜屏障破壞，同時促進細胞凋亡，但是RhoA/ROCK-2 信號通路導致OIS的具體機制仍需要進一步研究。

綜上所述，BCCAO術后可進一步激活視網膜中RhoA/ROCK-2 通路，研究RhoA/ROCK-2 通路在OIS中的作用及機制，將為OIS的防治提供新的思路。本實驗組大鼠視網膜中R h o A及ROCK-2在不同時間點的表達及具體下游靶點仍待進一步研究。