老年SD大鼠自發(fā)性腫瘤的病理學(xué)觀察

周曉麗，張 倩，高 崢，錢智勇

（天津市疾病預(yù)防控制中心毒理科，天津 300011）

新藥致癌性研究是藥物非臨床安全性評價的重要內(nèi)容，通過考察藥物在動物體內(nèi)的潛在致癌作用，評價和預(yù)測可能對人體造成的危害，并以風(fēng)險控制計劃、說明書、臨床監(jiān)察、上市后監(jiān)測等手段進行風(fēng)險控制[1]。由于致癌試驗需要6個月以上甚至更長（國際上致癌試驗一般周期為24個月）的動物給藥時間，對動物質(zhì)量（高質(zhì)量的動物可避免自發(fā)疾病對試驗結(jié)果的影響）、動物房環(huán)境、動物福利以及操作人員的技術(shù)要求（比如避免連續(xù)24個月經(jīng)口給藥時發(fā)生操作失誤）比較高。在致癌試驗動物（尤其是大鼠的品系）選擇中，針對不同藥物可以更好更合理挑選動物品種、品系和性別（如果需要）。在組織病理分析和診斷中，更準確判斷腫瘤和藥物的關(guān)系，綜合評價藥物對動物的致癌影響[2]。根據(jù)本實驗室最近開展的一項SD大鼠致癌試驗，本文分析該試驗中對照組120只SD大鼠喂飼2年后的各種腫瘤發(fā)生率，并進行病理學(xué)觀察。由于對照組未經(jīng)染毒和任何人為干擾，可以認為其發(fā)生的腫瘤病變及其發(fā)生率的高低在進行致癌試驗結(jié)果評價時具有重要的參照價值。另外，不同品系及不同批次大鼠的自發(fā)腫瘤及其發(fā)生率可存在一定的差異，本文進一步豐富了現(xiàn)有SD大鼠自發(fā)腫瘤病變及其發(fā)生率的資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

致癌試驗中正常對照組SPF級SD大鼠120只，雌雄各半，體質(zhì)量40～60 g，4周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2012-0001]。所有大鼠飼養(yǎng)于天津市疾病預(yù)防控制中心屏障設(shè)施內(nèi)[SYXK（津）2014-0001]，室溫控制在20～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h照明，12 h黑暗。動物按不同性別分籠飼養(yǎng)，對照組食用常規(guī)動物飼料，自由飲水，每周更換1次鼠盒及墊料。所有動物檢疫觀察1周，即觀察動物的活動、飲食等表現(xiàn)。動物在使用前，經(jīng)獸醫(yī)檢查合格后進行致癌試驗。

1.2 儀器與試劑

全自動Thermo染色機購自美國Thermo Electron公司，ASP3000全自動封閉脫水機和EG1150H石蠟包埋機購自德國Leica公司，BX51顯微鏡購自日本Olympus公司，CP323S天平購自德國Sartorius公司，蘇木精和伊紅染色液購自哈爾濱格林標本技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 大體病理學(xué)檢查

致癌試驗周期為104周，試驗結(jié)束后用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉動物，通過腹主動脈取血法將動物安樂死。常規(guī)檢查動物體質(zhì)、發(fā)育和營養(yǎng)狀況，檢查口、鼻、外耳、肛門和外生殖器等有無異常。系統(tǒng)剖檢包括臟器的位置、大小、色澤和質(zhì)地是否正常，有無粘連、腫瘤等，胸腔、心包、腹腔及顱腔有無積液或出血。著重檢查皮膚、皮下及各臟器有無包塊，注意包塊的色澤、硬度和大小等。試驗期間每日進行臨床觀察，將自然死亡與瀕死的動物及時進行剖檢。

1.4 組織病理學(xué)檢查

對致癌試驗過程中死亡的動物、因瀕死而被處死的動物、試驗結(jié)束時所有存活動物處死后均進行全面的大體解剖，解剖時詳細記錄腫瘤的部位、形狀、大小、質(zhì)地、顏色和腫瘤個數(shù)等。將下列組織用質(zhì)量分數(shù)4%的甲醛溶液固定，供進一步組織病理學(xué)觀察：病變及腫瘤組織、腦（包括大腦、小腦、腦干）、脊髓、心、肺、氣管、肝、脾、腎、胰、食管、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、腎上腺、垂體、甲狀腺（包括甲狀旁腺）、胸腺、附睪、睪丸、前列腺、卵巢、子宮、肌肉、骨、淋巴結(jié)和眼球等臟器。取固定的組織和器官，經(jīng)脫水后石蠟包埋，切片（厚度為3～5μm），蘇木精-伊紅（H E）染色，光學(xué)顯微鏡檢查。診斷術(shù)語參照美國毒性病理學(xué)會（Society of Toxicology Pathology）指導(dǎo)文件Standardized System of Nomenclature and Diagnostic Criteria。天津市疾病預(yù)防控制中心毒理科負責(zé)進行組織病理學(xué)檢查，并計算各種腫瘤病變的發(fā)生率。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用x-±s表示，兩組均值間比較采用獨立樣本t檢驗，率的比較用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對120只SD大鼠在不同時間段的死亡率進行統(tǒng)計。由于試驗過程中死亡7只，且發(fā)現(xiàn)時臟器已發(fā)生自溶，失去病理學(xué)觀察意義，因此僅對113只大鼠進行了病理學(xué)檢查，其中雌性大鼠56只，雄性大鼠57只。試驗期間觀察到這些大鼠的臨床主要表現(xiàn)為體表腫塊、脫毛、步態(tài)異常、活動減少、消瘦、腹瀉、會陰污穢、眼有血性分泌物等，個別動物出現(xiàn)下肢癱瘓和血尿。

2.2 死亡率

雌性大鼠最早死亡時間為試驗第49周，雄性大鼠最早死亡時間為第62周。死亡動物解剖時未發(fā)現(xiàn)異常，病理學(xué)觀察無器質(zhì)性病變。試驗第27～52周時動物死亡率為1.7%（2/120），雌性大鼠死亡率略高于雄性大鼠；隨著時間延長，死亡率呈現(xiàn)遞增趨勢，第53～78周死亡率為16.7%（20/120），雌雄大鼠死亡率相當；第79～104周死亡率為41.7%（50/120），雌性大鼠死亡率高于雄性（表1）。

表 1 20只SD大鼠不同時間段死亡率Table 1 Mortality of 120 SD rats in different time periods[n(%)]

2.3 腫瘤發(fā)生情況

總體腫瘤發(fā)生率為66.4%，單發(fā)和多發(fā)性腫瘤比例相似，詳見表2。

表 2 113只SD大鼠自發(fā)性腫瘤發(fā)生情況Table 2 Spontaneous tumorigenesis in 113 SD rats[n(%)]

2.4 良性腫瘤病理類型

雄性大鼠以垂體腺瘤最多見（36.5%），其次是腎上腺髓質(zhì)腺瘤（7.0%）。垂體腺瘤在解剖時可見垂體腫大，大小約0.3 cm×0.4 cm×0.4 cm，可與周圍組織完全剝離，有些可見局部出血；主要表現(xiàn)為嗜酸性腺瘤、嗜堿性腺瘤、嫌色細胞腺瘤和混合細胞腺瘤，其中嗜酸性細胞腺瘤多見，嫌色細胞腺瘤少見。其他的良性腫瘤有腎上腺皮質(zhì)腺瘤、甲狀腺瘤、皮膚纖維瘤和脂肪瘤等。

雌性大鼠以垂體腺瘤（50.0%）、乳腺纖維腺瘤（12.5%）和乳腺腺瘤（12.5%）最多見。垂體腺瘤臨床表現(xiàn)和大體解剖所見與前述的雄性大鼠基本相同。乳腺良性腫瘤大體解剖可見乳腺部位皮下單個或多個腫塊，最大直徑可達11～16 cm，可與周圍組織剝離，灰白色或伴有紅色區(qū)域。雌性大鼠其他良性腫瘤病變有腎上腺髓質(zhì)腺瘤、皮膚纖維瘤、甲狀腺腺瘤、子宮內(nèi)膜息肉和子宮平滑肌瘤等（表3）。

表 3 SD大鼠良性腫瘤病變類型及發(fā)生率Table 3 Histological types and incidences of benign neoplastic lesions in SD rats[n(%)]

2.5 惡性腫瘤病理類型及其發(fā)生率

從表4可見，雄性大鼠惡性腫瘤主要有甲狀腺癌（1.8%）和皮膚纖維肉瘤（1.8%），雌性大鼠惡性腫瘤主要有乳腺癌（25.0%）、皮膚纖維肉瘤（3.6%）、膀胱移形上皮細胞癌（1.8%）和肝癌（1.8%）等。有的動物腮部出現(xiàn)腫瘤，剛發(fā)現(xiàn)時多為直徑約1 cm的輕微隆起，長到直徑約3～5 cm時呈球形隆起，后期腫瘤表面潰破，內(nèi)部壞死，腫瘤壓迫一側(cè)眼睛和耳朵，也影響口腔攝食，解剖時與周圍組織界限不清，經(jīng)病理檢查其為腺癌。發(fā)生于內(nèi)臟器官的惡性腫瘤多數(shù)在動物死亡后才發(fā)現(xiàn)，可見惡性腫瘤病變已擴散到周圍組織，與周圍組織粘連在一起，或擴散至全身器官。此外，生長在皮下的球形惡性腫瘤病變與皮下良性細胞球形腫瘤的臨床和大體解剖情況類似，但生長較快，瘤體較大，腫瘤中心部位可見壞死，病理類型為纖維肉瘤，一般并發(fā)脾臟腫大，光學(xué)顯微鏡下可見脾臟髓外造血增加。典型腫瘤組織經(jīng)HE染色后病理學(xué)觀察結(jié)果見圖1。

表 4 SD大鼠惡性腫瘤病變類型及發(fā)生率Table 4 Histological types of malignant neoplastic lesions in SD rats and their incidences[n(%)]

圖 1 大鼠自發(fā)性腫瘤病理組織學(xué)觀察（HE染色）Figure 1 Pathological observation of spontaneous tumors in rats (HE staining)

3 討論

自發(fā)腫瘤是大鼠生物學(xué)特征的重要表現(xiàn)形式之一。自1979年開始，有報道顯示裸小鼠可自發(fā)腫瘤，隨后國外陸續(xù)有SPF級大鼠自發(fā)腫瘤的報道[3-4]。本文通過對新藥致癌試驗期為104周的正常對照組113只SD大鼠自發(fā)腫瘤的組織病理學(xué)檢查結(jié)果進行詳細分析，總結(jié)了雄性和雌性SD大鼠各種自發(fā)良性和惡性腫瘤病變及其發(fā)生率；結(jié)果顯示，雄性大鼠以垂體腺瘤和腎上腺髓質(zhì)腺瘤高發(fā)，雌性大鼠以垂體腺瘤、乳腺纖維腺瘤和乳腺腺瘤高發(fā)，這些高發(fā)的腫瘤均為良性腫瘤。肖成榮等[5]對喂養(yǎng)2年的Wistar大鼠生存、體質(zhì)量及進食量進行觀察與分析，發(fā)現(xiàn)雄性大鼠死亡率、死亡動物平均活存時間具有高于雌性大鼠的趨勢，雌性大鼠的自發(fā)性腫瘤發(fā)生率較雄性大鼠略高，并且存在同一只大鼠多器官發(fā)生腫瘤的現(xiàn)象。

腫瘤的發(fā)生與性別相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，雌性大鼠惡性腫瘤發(fā)生率高于雄性大鼠。動物腫瘤生態(tài)學(xué)研究[6]結(jié)果表明，在1 077例腫瘤中，雌性動物的腫瘤發(fā)生率高于雄性和去勢動物，雌性占48.7%，雄性占40%，去勢動物占11.3%。性別差異也因腫瘤良惡性不同有所區(qū)別。良性腫瘤中，雄性動物的檢出例數(shù)多于雌性和去勢動物；惡性腫瘤則相反，雌性動物的檢出例數(shù)明顯多于雄性和去勢動物。雌性大鼠惡性腫瘤發(fā)生率遠遠高于雄性大鼠的原因可能是，檢出率高的好發(fā)惡性腫瘤如乳腺癌等多發(fā)生于雌性大鼠。本文還詳細介紹了與腫瘤病變相關(guān)的臨床表現(xiàn)和大體解剖所見，可為相關(guān)技術(shù)人員特別是初次開展SD大鼠致癌試驗的人員提供一些參考和借鑒。

根據(jù)腫瘤發(fā)生率進行評定時，主要通過統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗來評價，如果染毒組的腫瘤發(fā)生率高于對照組且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（最好具有劑量-反應(yīng)關(guān)系），則認為致癌試驗結(jié)果為陽性[7]。有研究[8]表明，當對照組腫瘤自發(fā)率分別為1%、5%、10%、20%和30%，染毒組腫瘤發(fā)生率相應(yīng)為20%、30%、40%、50%和60%時，才有90%的把握度獲得陽性結(jié)果。動物數(shù)不變的情況下，如果對照組動物自發(fā)性腫瘤發(fā)生率很高，則可降低統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗的效率，掩蓋受試物所引起的腫瘤病變發(fā)生率的增高，干擾對研究結(jié)果的準確評價[7]。

不同實驗室、不同品系大鼠、不同批次大鼠以及不同時間開展的致癌試驗中，動物自發(fā)性腫瘤類型及其發(fā)生率可存在一定的差異。對于同一種屬、同一品系、同一實驗室條件下飼養(yǎng)的大鼠，其自發(fā)腫瘤的發(fā)生率隨著動物生命周期的延長而增加[9]，這與本實驗結(jié)果一致。有文獻報道[10]，176只SD大鼠中雄性大鼠良惡性腫瘤發(fā)生率分別為35.6%和16.1%，雌性大鼠良惡性腫瘤發(fā)生率分別為61.8%和15.7%；本研究中雄性大鼠良惡性腫瘤發(fā)生率分別為50.9%和3.5%，雌性大鼠良惡性腫瘤發(fā)生率分別為51.8%和32.1%。文獻[10]報道中雄性大鼠惡性腫瘤發(fā)生率高于本研究結(jié)果，這種現(xiàn)象可能與SD大鼠來源、樣本數(shù)量和飼養(yǎng)條件等因素有關(guān)。Son[11]統(tǒng)計了1 284只雄性SD大鼠和1 264只雌性SD大鼠的自發(fā)腫瘤情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SD大鼠最常發(fā)生的腫瘤為垂體腺瘤，其次為乳腺纖維腺瘤和乳腺癌；在50周致癌實驗終點安樂死的動物中，垂體腺瘤的發(fā)生率分別為雄性37%和雌性79.5%。本研究中腫瘤發(fā)生率最高的類型分別是雄性大鼠的垂體腺瘤和腎上腺髓質(zhì)腺瘤，雌性大鼠的垂體腺瘤、乳腺纖維腺瘤和乳腺腺瘤，其中垂體腺瘤的發(fā)生率分別為雄性36.8%和雌性50.0%，且雌性發(fā)生率高于雄性，這與Son的結(jié)果一致。

SD大鼠、F344大鼠和TR1及TR2系大鼠自發(fā)腫瘤發(fā)生率的資料表明，這些品系大鼠的自發(fā)腫瘤也以垂體腺瘤和乳腺瘤最高發(fā)[12-15]。這些品系大鼠中以 SD大鼠的自發(fā)腺瘤發(fā)生率最高，可達70%；本研究中113只SD大鼠自發(fā)腫瘤總體發(fā)生率為66.4%，與該結(jié)論接近。本文報告的SD大鼠自發(fā)腫瘤及其發(fā)生率進一步豐富了現(xiàn)有SPF級SD大鼠自發(fā)性腫瘤的數(shù)據(jù)資料，可為我國毒性致癌試驗的安全性評價提供一定的參考和借鑒。