基于冷凍腫瘤組織切片的磷酸化HER2免疫組織化學染色方法探討

范姝瓊 ， 鄭 莉

[1. 迪哲（上海）醫藥有限公司，上海 201203；2. 復旦大學生命科學學院，上海 200433]

原癌基因編碼蛋白人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）作為表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）家族成員之一，當基因擴增或過表達時會形成同源二聚體，或與EGFR家族其他成員形成異源二聚體，激活下游細胞通路，影響細胞的生長與增殖等功能[1-2]。腫瘤分子標志物存在于腫瘤組織中，當機體發生癌變時，與之相對應的癌因子會發生功能性的改變。因此，通過對腫瘤分子標志物的檢測可以及早發現腫瘤患者，并監測其臨床治療效果以及評估預后。腫瘤分子標志物在細胞中的精準定位及表達水平與分子靶向藥物的治療效果密切相關[3]。在早期藥物研發階段，通過腫瘤分子標志物檢測和判讀，可以直接驗證靶向化合物的作用機制，分析化合物在動物模型中達到的藥效動力學，幫助了解藥效動力學和藥代動力學的相關性。磷酸化HER2（phospho-HER2，p-HER2）作為HER2抑制劑的直接作用靶點，是最直接最理想的藥效驗證靶向蛋白[4]。從技術手段角度來說，免疫組織化學方法方便、快捷、易于操作，醫院病理科以及中心實驗室都具備比較成熟的免疫組織化學檢測技術和實驗條件，易于推廣。

在實際科研和病理診斷工作中，冷凍切片在操作上相較于石蠟切片更快速，常用于短時限內病理診斷與生物標志物的檢測。但冷凍切片的組織形態與抗原穩定性容易受外部因素的影響，例如切片溫度、不同的組織固定液和切片存儲條件等[5-6]。 相較于石蠟切片，多次制片更容易對冷凍組織造成不可逆的損失和損傷。本文通過對比不同的固定條件和存儲時間，觀察免疫組織化學染色過程中p-HER2的信號變化，探討針對p-HER2檢測過程中冷凍組織切片的最佳固定與保存條件。

1 材料與方法

1.1 動物模型

6～8周齡雌性BALB/c-nu/nu小鼠10只，體質量為20～25 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司[SCXK（京）2016-0011]，飼養于迪哲（上海）醫藥有限公司動物實驗室[SYXK(滬)2018-0015]。實驗正式開始前，需將動物在新環境中適應性飼養1周。選取p-HER2高表達的人源性乳腺癌細胞株BT474，通過腹部皮下注射的方法建立小鼠皮下移植瘤模型，建模成功率為60%（6/10）。本實驗符合迪哲（上海）醫藥有限公司動物倫理委員制定的倫理學標準（IACUC：

1804-ONM-02）。

1.2 試劑

抗p-HER2（6B12）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，免疫組織化學檢測試劑盒購自瑞士Ventana Roche公司，冷凍包埋劑OCT購自美國Thermo公司，蘇木精購自美國Sigma公司，甲醛、無水乙醇和乙酸均購自國藥集團藥業股份有限公司。乙醇-乙酸-甲醛（AAF）混合固定液的配制：冰醋酸5 mL，37%甲醛溶液10 mL，無水乙醇85 mL。

1.3 儀器

冷凍切片機Leica CM3050S Motorized Cryostat和病理切片病理數字掃描系統Aperio ScanScope均購自德國Leica公司，全自動免疫組織化學染色儀Ventana Discovery XT購自瑞士Ventana Roche公司。

1.4 制片

接種后第5日起，每隔3 d用游標卡尺測量移植瘤體的長徑（L）、短徑（W）1次，取平均值，按公式V＝1/2（L×W2）計算移植瘤平均體積。待裸小鼠BT474細胞皮下腫瘤生長至約300 mm3時處死小鼠，剝離腫瘤組織，用液氮速凍[7]，連續冰凍切片（厚度為5μm）。然后進行最佳固定與保存條件的探索。

1.5 切片固定

實驗分3部分。（1）探索不同固定液對p-HER2免疫組織化學染色信號的影響：制作2組冷凍組織切片，分別用體積分數10%的中性甲醛固定液和AAF固定液處理5 min，然后進行免疫組織化學染色。（2）探索冷凍切片后不同時間點進行甲醛溶液固定對p-HER2免疫組織化學染色信號的影響：冷凍制片后1、5、20和30 min后，用10%中性甲醛溶液固定5 min，然后進行免疫組織化學染色。（3）探索冷凍切片固定后在超低溫保存條件下的抗原穩定性：采用逆向計算實驗時間的方法，在不同時間制備冷凍組織切片；未染色的切片經過固定后，置于－20 ℃冰箱內存儲；切片分別經過1周、4周和12周后，與新鮮制備的冷凍切片一同進行免疫組織化學染色，并將所有切片的染色結果與新鮮切片染色結果進行對比。

1.6 免疫組織化學染色

用全自動免疫組織化學染色儀進行免疫組織化學檢測。在制作好的切片上滴加質量濃度為3.4 μg/mL的兔抗人p-HER2（Tyr1221/1222）單克隆抗體，孵育20 min后，洗去一抗；再滴加即用型Ultra Map過氧化物酶標記的羊抗兔二抗試劑，孵育16 min，再用ChromoMap DAB進行顯色。顯色完成的切片滴加蘇木精染液，再滴加藍化試劑進行返藍，完成組織細胞核的對比染色程序。染色完成的切片在無水乙醇中清洗，然后置于自動封片機上封固。

1.7 結果判讀

免疫組織化學染色切片經Aperio成像系統掃描歸檔，染色結果由病理醫師進行觀察、對比，并截圖拍照。

2 結果

2.1 不同固定液對p-HER2免疫組織化學染色結果的影響

用10%中性甲醛固定液處理后，切片組織結構完整，細胞形態和結構清晰，p-HER2的免疫組織化學染色信號清晰可判讀（圖1A）。用AAF固定液處理后，雖然切片組織和細胞結構清晰，但p-HER2的免疫組織化學染色信號強度相對較弱（圖1B）。

2.2 BT474腫瘤組織固定前抗原的穩定性

BT474移植瘤組織在冷凍制片后5～20 min進行甲醛溶液固定，組織黏附性好，染色過程中不易掉片，光學顯微鏡下顯示組織結構與細胞形態清晰，p-HER2染色信號穩定無差異（圖1C～E）。冷凍制片30 min后再行甲醛溶液固定的切片中，p-HER2染色信號開始下降。 冷凍組織制片后立即進行甲醛溶液固定的切片在光學顯微鏡下顯示組織黏附性較差，在染色沖洗過程中容易掉片，細胞結構不夠清晰，p-HER2免疫組織化學信號彌散（圖1F）。

圖 1 冷凍組織切片中p-HER2免疫組織化學染色結果(DAB顯色)Figure 1 Immunohistochemistry staining result of phospho-human epidermal growth factor receptor 2 (p-HER2) in frozen sections (DAB coloring)

2.3 BT474腫瘤組織固定后抗原的穩定性

利用全自動染色儀對新鮮及經過長時間保存的冷凍組織切片進行免疫組織化學染色。結果顯示，未經染色的冷凍組織切片經過12周的存儲后，組織黏附性好，染色過程中沒有發生組織脫落的現象，且組織與細胞形態完整清晰；p-HER2免疫組織化學染色信號清晰，其信號強度與固定完當日即行免疫組織化學染色的切片相比沒有明顯差異（圖2）。

圖 2 未染色的冷凍組織切片經過不同時間保存后p-HER2免疫組織化學檢測結果（DAB顯色）Figure 2 Immunohistochemistry staining result of phospho-human epidermal growth factor receptor 2 (p-HER2) in frozen sections stored for different time (A, 0 day;B, 1 week; C, 4 weeks; D, 12 weeks) (DAB coloring)

3 討論

免疫組織化學染色作為生物標志物常用檢測方法，利用抗原抗體結合以及化學顯色反應，反映組織細胞中的蛋白含量及分布情況。由于其方法相對簡單，因此普及率相當高，在醫院內常用于輔助患者明確病理診斷，從而提供依據幫助選擇合適的靶向治療方案，以及用于判斷患者的預后情況。在新藥研發的過程中，免疫組織化學染色方法也常用于確定藥物的作用機制，并分析藥代動力學與藥物效果的相關性。常規的免疫組織化學實驗采用經甲醛溶液固定的石蠟組織切片，其優點是樣品易于保存，而缺點是從樣品采集、充分固定到石蠟切片制備完成所需要的時間較長，而且在實驗過程中經過固定的抗原需要先進行抗原修復。而冷凍組織切片相較于石蠟組織切片而言，其制片非常快速，抗原保存完好，而且切片染色可以滿足病理診斷的要求；冷凍組織切片由于當天即可完成免疫組織化學染色，可以幫助醫生與科研人員在盡可能短的時間內得出結論，因此該方法在醫院臨床實踐以及科研工作中都具有一定的優勢。

本實驗通過比較針對冷凍組織切片的不同固定條件與保存時長對免疫組織化學信號的影響，探索多組樣本量情況下冷凍組織制片操作與存儲中可靈活調整的時間段，優化針對同一樣本多種生物標志物檢測的制片規劃，減少多次制片引起的反復凍融而導致冷凍樣本遭受不可逆的形態損傷與抗原丟失問題。

醛類固定液會使蛋白質發生交聯[8]，而乙醇通過沉淀蛋白發揮固定作用，同時兼有脫水作用[9]，因此10%中性甲醛溶液與AAF混合溶液均是醫院與各科研院所廣泛使用的針對冰凍細胞與組織切片的固定試劑。經過短時間的固定液處理，用10%中性甲醛溶液固定的冷凍切片中的細胞形態與免疫組織化學染色信號強度相比于用AAF混合溶液固定過的樣品更為清晰，更有利于研究者在光學顯微鏡下進行判讀打分。

冷凍組織切片中未經固定的磷酸化蛋白降解非常迅速。本實驗對p-HER2抗原的穩定性進行了分析，發現在冷凍組織制片5～20 min采用10%中性甲醛溶液固定后，檢測到的p-HER2免疫組織化學染色信號強度與新鮮切片沒有明顯差異；而在冷凍制片經過30 min后再進行固定的切片中，檢測到的p-HER2免疫組織化學染色信號明顯減弱。本研究發現p-HER2在20 min內擁有良好的抗原穩定性，這為日常工作中大批量冷凍樣品制片提供了一定的靈活操作時間。

綜上所述，利用冰凍組織切片進行免疫組織化學染色的可操作性強，需要染色時間短，在提高工作效率的同時不影響染色結果的判讀，可以考慮將其作為常規石蠟切片染色方法的補充或者替代。然而，冷凍組織切片未經固定即暴露于外界，不僅組織形態容易遭受損傷，組織抗原信號也會降解甚至消失。本研究發現，冷凍組織制片后5～20 min，經過10%中性甲醛溶液充分固定后的組織形態結構清晰，p-HER2蛋白穩定性較好，而且－20 ℃條件下保存3個月之內仍可以較好保存其抗原性，這一發現對實際檢測工作具有一定的價值。