翻白草對TNBS誘導的急性潰瘍性結腸炎大鼠促炎因子及趨化因子的影響*

史夢妮，付騫卉，劉 宇，柯愈詩，劉偉志

(中央民族大學民族醫藥教育部重點實驗室，北京 100081)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC) 是一種反復發作的腸道炎癥性疾病，臨床主要表現為腹瀉、腹痛及黏液膿血便，嚴重影響患者的生活質量。到目前為止，雖然UC的發病機制尚未完全明確，但相當多的研究證實，免疫炎癥反應在 UC 的發病發展中都起到重要的作用[1]。有研究表明，當炎癥破壞局部腸道黏膜免疫屏障并打破內環境穩態時，會導致Th1 /Th2、Th17 /Treg免疫平衡失調，從而引發UC[2]。因此，由Th1和Th17細胞產生的促炎細胞因子(如IFN-α、TNF-α和IL-17 A)被認為是炎性腸病關鍵因子。研究證明，募集炎性因子可導致炎癥反應，且誘導白細胞遷移和活化所需的趨化因子也可能在UC的發病機制中起重要作用。

臨床治療 UC 的常用藥氨基水楊酸類機制之一就是抑制機體免疫反應，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)單克隆抗體對傳統治療無效的活動性 UC 有效，但由于其價格昂貴且有一定的不良反應，限制其廣泛應用。而傳統醫藥在治療 UC 方面有悠久的歷史，其特點是毒副作用小，對緩解病癥及預防復發有一定的優勢。翻白草(PotentilladiscolorBunge.)為薔薇科多年生草本植物，始載于《救荒本草》，其味甘、微苦、性平，歸肝、胃、大腸經，具有止血止痢、清火解毒、祛風除濕、消腫止痛的功效。彝醫常用翻白草治療瘧疾、痢疾、瀉痢便血。在前期研究中發現，翻白草能夠調控 UC 模型大鼠血清中白細胞介素(IL-4、IL-5、IL-10)免疫因子水平，且抑制NF-κB p65蛋白表達，調節UC模型大鼠免疫因子的紊亂，促進腸黏膜修復。本實驗將進一步探索翻白草醇提物對三硝基苯磺酸(3-Nitrobenzenesulfonic acid，TNBS)-乙醇灌腸法復制的UC大鼠模型藥效以及對其結腸組織中Th1/ Th17與趨化因子表達的干預作用。

1 材料

1.1 動物

本實驗全部采用SPF級Wistar大鼠作為實驗動物，雄性60只，體質量200 g～220 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK(京)2016-0006，飼養于SPF級動物房[SYXK (京) 2016-0043]，常規飲食，適應性飼養7 d，自由飲食飲水，飼養溫度為恒溫20～22 ℃，濕度保持在40%～70%。本實驗已通過中央民族大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 藥材

本實驗所用藥材皆是從四川省涼山彝族自治州收集的彝藥翻白草，由中央民族大學藥學院朱丹教授鑒定為薔薇科(PotentilladiscolorBunge.)。按適當比例稱重5 kg，加入80%乙醇，回流提取5 h，將提取物濃縮至高劑量0.72 g·kg-1，中劑量0.36 g·kg-1和低劑量0.18 g·kg-1生藥，4 ℃下避光保存。

1.3 試劑

柳氮磺吡啶(上海新益平衡藥業有限公司，批號09130714)獨立研磨成粉末，經100目篩網過濾，制備0.36 g·kg-1；三硝基苯橫酸(TNBS，5%(w /v)，sigma公司(P2297))；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京Solarbio生物科技有限公司，批號20170920)；bio-plex pro懸浮芯片(美國Bio-Rad公司，171K1001 M)；無水乙醇(北京化工廠，AR)。

1.4 儀器

bio酶標儀(BIO-TEK公司)；Elx800洗板機(BIO-TEK公司，Elx50)；RE-52 A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；高速離心機(上海安亭科學儀器廠TGL-16B)；干燥箱(日本三洋，MIR-153型)；分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，AL104型)；循環水式真空泵(河南省予華儀器有限公司，SHZ-D(Ⅲ))。

2 方法

2.1 分組與造模

將所有Wistar大鼠按隨機數字表法分為正常對照組、UC模型組、翻白草高劑量組、翻白草中劑量組、翻白草低劑量組、柳氮磺吡啶組6組各10只。采用TNBS/無水乙醇改良復合法建立UC模型[3]。正常對照組除外，所有大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后通過局部灌腸，將石蠟油浸潤直徑2 mm、長10 cm圓頭導管由肛門插入結腸內深約8.0 cm，對UC模型組和不同治療組的大鼠一次性將100 mg/kg TNBS和50%乙醇混合的TNBS/乙醇液0.25 mL緩慢推注入大鼠結腸內，正常對照組大鼠用等量生理鹽水灌腸，每只大鼠使用新灌腸管。3 d后隨機選取5只大鼠處死取結腸段，經組織切片觀察確定造模是否成功。造模成功后給予灌胃(1 mL/100 g)治療 14 d，空白組和模型組小鼠給予0.9%生理鹽水。實驗期間每天觀察大鼠一般情況、稱體質量、檢測便潛血及性狀。

2.2 標本采集與處理

末次給藥后禁食不禁水。次日麻醉后在裝有碎冰的培養皿中迅速進行全結腸截取，將骨盆剪開徹底暴露盆腔，從肛門到膨大的回盲部全部取出，沿腸系膜縱軸剪開腸腔，冰PBS沖洗后觀察結腸黏膜損傷情況；取結腸放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片4 μm，HE染色觀察病理。

2.3 疾病活動指數及結腸組織病理學評分

表1示，根據疾病活動指數(disease active index，DAI)評分標準，對UC大鼠體質量、大便性狀及便血情況進行觀察。

表1 DAI評分量表

2.4 結腸組織病理學觀察

各組末次給藥后禁食24 h，腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉、固定、剖檢，取肛門上2～8 cm處結腸組織浸泡于4%多聚甲醛液中固定，待充分固定后置于真空組織脫水機中以梯度乙醇脫水及二甲苯透明，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察結腸黏膜形態。

2.5 大鼠結腸組織炎性因子及趨化因子表達水平檢測

剪取新鮮潰瘍組織加入RIPA裂解液，低溫環境下研磨成組織勻漿液；低溫下利用超聲波粉碎儀對組織勻漿液進行超聲, 工作10 s，間隔30 s，30個循環；4 ℃，10000 r/min離心20 min取上清，BCA法進行蛋白定量后分裝，-20 ℃保存。應用蛋白芯片檢測大鼠結腸組織中IL-17、TNF-α、IFN-γ、MIP-1α以及趨化因子(RANTES)的含量，實驗操作按照bio-plex pro檢測盒說明書進行。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 模型評價及DAI評分結果

表2示，造模前各組大鼠體質量基本一致，反應敏捷，大便正常，隱血試驗結果陰性。建立模型后，UC模型各組大鼠活動度降低，體質量先大幅降低后趨于平穩，大便隱血或便血。給藥后，各組小鼠飲食飲水逐漸恢復正常，體質量逐漸增長，部分大鼠大便便血情況消失，少數大便隱血，逐漸恢復成顆粒便。與模型組比較，柳氮磺吡啶組和翻白草高劑量組的 DAI 評分下降較明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 翻白草對UC大鼠DAI評分的影響

3.2 對UC大鼠結腸組織病理變化的影響

圖1示，觀察空白組腸壁4層結構明顯，結腸腺體排列規則，隱窩結構明顯。模型組黏膜潰瘍明顯，腸壁4層不明顯，黏膜層和黏膜下層富含炎癥細胞。柳氮磺胺吡啶組與翻白草治療組中UC大鼠的腸壁結構基本清晰，4層結腸明顯分層，在固有層、黏膜下層甚至肌層黏膜中都可見大量彌漫性淋巴細胞。在高劑量組和柳氮磺胺吡啶組中，結腸直腸腺排列整齊，黏膜下層可見較大的淋巴結，腺體部分擴張，較模型組明顯改善。中低劑量組4層結構明顯，結腸腺排列整齊，但黏膜下層和固有層可見大量彌漫性炎癥細胞。

注：A.對照組；B.模型組；C.柳氮磺吡啶組；D.翻白草高劑量組；E.翻白草中劑量組；F.翻白草低劑量組圖1 翻白草醇提物對UC大鼠結腸組織病理變化的影響(HE ×200)

3.3 翻白草對大鼠結腸組織中炎性因子和趨化因子表達的影響

表3示，與空白對照組比較，模型組大鼠結腸組織中IFN-γ水平顯著增加。與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織中IFN- γ和TNF-α表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.001和P<0.01)。

表4示，與空白對照組比較，UC模型大鼠的RANTES以及IL-17的含量顯著增加(P<0.001和P<0.01)。與模型組比較，各給藥組中RANTES和IL-17的表達顯著下降，差異有統計學意義(P<0.001和P<0.01)。UC大鼠結腸組織中MIP-1α的含量與空白對照組比較有所增加(P<0.05)，與模型組比較，柳氮磺吡啶組能夠下調MIP-1α含量(P<0.05)，翻白草高、中、低劑量組中MIP-1α的含量僅有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 翻白草對大鼠結腸組織中IFN- γ和TNF-α表達的影響

4 討論

本研究所建立的TNBS誘導UC模型是一種腸黏膜損傷模型，它與UC中黏膜的損傷類似。在UC的病程發展中，因為失去了屏障保護功能而受損的結腸上皮細胞為抵御微生物的侵襲，從而表現出免疫細胞的浸潤以及炎性介質的分泌。CD+4 T細胞則在這種獲得性免疫中發揮重要作用，分化為不同功能的輔助性T(Th)細胞(Th1、Th2和Th17)和調節性T細胞(Treg)，從而在正常人體中維持著免疫分子表達的動態平衡。其中Th1/Th17亞群細胞比例升高在UC發病機制中發揮著重要作用[4]。因為Th1和Th17細胞的過度聚集打破了免疫平衡，抑制Th2及Treg細胞分泌，這些細胞因子在級聯網中相互連接，并且在適應性免疫反應過程中不斷產生，從而導致持續的炎癥反應。因此治愈UC的關鍵就在于減輕黏膜損傷和由此導致的免疫反應，維持免疫平衡以及抑制炎癥至關重要[2]。Th1細胞表達轉錄因子，通過分泌白細胞介素-1(IL-1)和TNF-α、IFN-γ等多種細胞因子調節細胞免疫；Th17表達轉錄因子可分泌IL-17 A、IL-17F、IL-21、IL-22及TNF-α，其中IL-17 A作為Th17分泌的主要效應因子可作用于多種細胞，介導組織浸潤及組織損傷[5]。IL-17 A在局部炎癥腸病中誘導促炎細胞因子的表達，導致腸道黏膜被破壞造成持續性炎癥損傷，是UC發病機制的核心參與者[6]。在UC患者的腸道黏膜中可檢測到高表達水平的IL-17 A和TNF-α，并通過免疫組織化學觀察發現，其在腸道固有層聚集[7-8]。本實驗結果中,UC模型組結腸組織中的IL-17 A表達顯著升高，經翻白草干預后下調結腸組織中的表達，說明翻白草可能通過抑制IL-17 A的表達,從而促進黏膜屏障的修復。

表4 翻白草對UC大鼠結腸組織RANTES、MIP-1α和IL-17表達的影響

目前在炎性腸病中，趨化因子的靶向給藥受到越來越多的關注。RANTES是由CD+8 T細胞、上皮細胞、成纖維細胞和血小板分泌,其具有多種不同的生物學功能。有研究發現，其在UC早期發病機制中發揮著重要作用，在UC患者病變組織中RANTES呈現出高表達[9]。RANTES也是TLR信號通路中的重要節點，可促進下游炎癥因子的釋放[10]。Kucuk[11]等將趨化因子拮抗劑(Met-RANTES)用于治療實驗性UC小鼠模型，發現Met-RANTES可以競爭性地結合趨化因子受體，從而阻斷RANTES和巨噬細胞炎性蛋白1-α (MIP-1α)的趨化作用。MIP-1α又稱趨化因子CCL3，它可以募集炎性細胞到感染部位，通過炎性細胞及其分泌的細胞因子發揮抗感染作用。RANTES和MIP-1α屬于 CC 趨化因子家族，主要趨化和激活單核細胞、某些 T 細胞亞群，在整合素、選擇素等參與下，募集循環中免疫因子浸潤到受損組織從而發揮作用[12]。

從本次研究中發現，與模型組比較翻白草能夠降低大鼠RANTES表達含量，然而翻白草并不能調節大鼠結腸MIP-1α含量。其可能是因為腸黏膜損傷雖然由腸上皮細胞分泌產生，但翻白草對UC大鼠結腸的保護并不主要通過抑制特異性趨化單核細胞/巨噬細胞，使其到達腸黏膜受損處發揮作用。

在炎性腸道中，趨化因子募集炎性因子，從而導致免疫失衡[12]，而IFN-γ在單核細胞和粒細胞的募集中又發揮了重要作用，其分泌的促炎細胞因子誘導白細胞過度募集在黏膜病變的部位,從而造成持續性炎癥和組織損傷。IFN-γ通過刺激Th17細胞產生IL-17 A等細胞因子，促使其打破腸黏膜免疫平衡，而IL-17 A又進一步刺激TNF-α及趨化因子的釋放。因此，本研究從黏膜免疫平衡角度探討翻白草醇提物改善UC大鼠腸黏膜損傷的潛在機制。實驗研究發現，與模型組比較，翻白草粗提物和柳氮磺吡啶給藥組的DAI評分降低，表明其改善UC大鼠病理狀態。此外，從UC大鼠的HE染色結果中發現，與模型組比較，翻白草給藥組UC大鼠的黏膜組織潰瘍程度更輕，治療后結腸分層明顯，恢復腺體的擴張，減少彌漫性炎性細胞浸潤，這種改善顯然與TNBS誘導結腸損傷的免疫反應相關。研究證實，翻白草化學成分包括三萜類化合物和黃酮類混合物，除此之外還分離出水解鞣質、甾醇和一些芳族酸。

綜上所述，本研究在TNBS誘導的UC大鼠模型中，根據DAI評分以及檢測IFN-γ、IL-17、TNF-α、RANTES和MIP-1α含量，探索翻白草醇提物對急性UC模型大鼠結腸損傷的作用機制。經翻白草醇提物干預后，較模型組改善急性UC大鼠腸病理損傷，結腸黏膜IFN-γ、IL-17、TNF-α和RANTES表達水平有明顯減少的趨勢。翻白草高劑量組與柳氮磺嘧啶有相近的效果，翻白草祛風扶正、收斂止瀉，能拔出腸壁內風邪之毒，使機體元氣充盈，重新恢復運化水液平衡，從根本上達到徹底治愈的目的。表明翻白草可能是通過調節Th1/Th17細胞，抑制促炎因子分泌，下調趨化因子的表達，降低炎癥細胞的募集和活化，恢復腸道黏膜免疫功能，進而調整腸黏膜免疫失衡，減輕大鼠腸黏膜損傷。本研究為翻白草提取物防治急性潰瘍性結腸炎的作用機制奠定了一定的實驗基礎。