淺析CRISPR-Cas9技術(shù)及其應(yīng)用

（河南師范大學(xué)附屬中學(xué)，河南新鄉(xiāng) 453002）

0.引言

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，人們對基因的研究進(jìn)一步深入。基因編輯就是一種新型的能對基因組進(jìn)行編輯的技術(shù)。目前對基因編輯的研究已經(jīng)有了一定進(jìn)展，可以對想要編輯的基因進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定點(diǎn)編輯。

核酸酶經(jīng)基因工程改造后可用于基因編輯，作用主要是在目標(biāo)基因位點(diǎn)進(jìn)行剪切，從而導(dǎo)致基因斷裂，生物體可通過自身的修復(fù)機(jī)制修復(fù)斷裂，在修復(fù)過程中可能會出錯(cuò)，將錯(cuò)誤的基因整合連接起來，而導(dǎo)致靶向突變，我們稱其為基因編輯。高效率是基因編輯技術(shù)的重要優(yōu)勢之一，因此未來如果能將基因編輯技術(shù)準(zhǔn)確靈活運(yùn)用于醫(yī)療和抵御治療疾病，將會帶來很大的便利，進(jìn)一步推動現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展。

1.技術(shù)方法

基因編輯的方法隨著科技的進(jìn)步而不斷變化，最開始是通過同源重組改變編輯基因，即將想要改變的DNA片段分離，再整合入目標(biāo)細(xì)胞中，這些外來的DNA片段通過直接注射或化學(xué)物質(zhì)促進(jìn)的方法被細(xì)胞所吸收，進(jìn)一步與原有DNA結(jié)合，重組到目標(biāo)位置。同源重組方法的發(fā)現(xiàn)是基因編輯技術(shù)研究的一大進(jìn)步，但這種方法具有不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，并且效率很低，目前已經(jīng)不再使用。

在特定位點(diǎn)產(chǎn)生斷裂后才能進(jìn)行基因編輯，關(guān)鍵在于“切割”和“特定”。限制酶是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)和研究中常用的用來切割DNA的工具，它可以有效地?cái)嗔袲NA，但在確定切割位置的方面還不夠準(zhǔn)確，容易出錯(cuò)。因此，人們針對這一缺點(diǎn)用生物工程改造了四種核酸酶，研發(fā)出了特異性更好的“DNA剪刀”。

巨型核酸酶特點(diǎn)如其名，識別范圍非常大，正是因?yàn)樗梢詥未巫R別12～40個(gè)堿基對的序列，因此它的特異性更強(qiáng)，同時(shí)也更加準(zhǔn)確。即使在非常復(fù)雜的基因組中，我們也可以利用鋅指核酸酶做到準(zhǔn)確定位和切割，較為準(zhǔn)確，如果在設(shè)計(jì)鋅指結(jié)構(gòu)域時(shí)多加注意，這種方法可以作到對高等生物甚至于人的基因進(jìn)行準(zhǔn)確的編輯。CRISPR/Cas9技術(shù)是一種非常有效的基因編輯的方法，通過這種方法使生物具有對外來物質(zhì)的抵擋能力，多用于治療預(yù)防疾病，應(yīng)用非常廣泛[1]。

2.在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

早在20世紀(jì)，隨著對免疫學(xué)研究的深入，研究者們就提出了通過適當(dāng)改變自身免疫系統(tǒng)的功能來控制并殺死腫瘤細(xì)胞的想法，稱為腫瘤免疫療法。20世紀(jì)80年代左右，研究者們開始尋找治療腫瘤的方法，他們將滅活的不同菌種的過濾物混合體外培養(yǎng)，嘗試抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和殺死腫瘤細(xì)胞，并取得了成功。在1950年左右，研究者又提出了新的理論，即“腫瘤的免疫監(jiān)視理論”，認(rèn)為自身免疫系統(tǒng)可以識別并殺死體內(nèi)出現(xiàn)異常的腫瘤細(xì)胞，這一理論給后人利用免疫系統(tǒng)治療腫瘤疾病提供了很大的啟發(fā)。在當(dāng)代，對腫瘤疾病的研究日益推進(jìn)，腫瘤免疫治療在治療多種臨床疾病方面都取得了不錯(cuò)的成效。而隨著對CRISPR /Cas9基因編輯技術(shù)的研究深入，研究者們對腫瘤疾病的治療找到了新的思路。

科學(xué)家們通過研究古生菌，從而發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9，即基因編輯系統(tǒng)。它可以對目標(biāo)位置的RNA進(jìn)行準(zhǔn)確的編輯，是一種獲得性免疫系統(tǒng)。像經(jīng)基因工程改造后的核酸酶一樣，CRISPR/Cas9也具有在特定位點(diǎn)切割和連接的作用,其作用原理是利用向?qū)NA結(jié)合Cas9蛋白并將其結(jié)合體引至PAM識別位點(diǎn)DNA靶標(biāo)位置上，進(jìn)一步進(jìn)行切割誘導(dǎo)產(chǎn)生DSB（Double-Strand Break）,通俗講即目標(biāo)DNA雙鏈斷裂。在機(jī)體察覺到斷裂后，真核細(xì)胞就會利用自身的DSP修復(fù)功能修補(bǔ)斷裂，這一步驟就是基因編輯進(jìn)行的關(guān)鍵，研究者需要利用DSP修復(fù)中相比同源重組更容易出錯(cuò)的一種途徑來完成滅活靶基因的目的。出錯(cuò)的原因常表現(xiàn)為以下兩種，一是直接的錯(cuò)誤修復(fù)連接；二是突變產(chǎn)生堿基漏插，一旦出現(xiàn)錯(cuò)誤，機(jī)體即敲除滅活靶基因。基因編輯技術(shù)雖仍存在許多細(xì)節(jié)上的不足，但與以前的技術(shù)相比，已經(jīng)有了突破性的進(jìn)步，且目前在無論是在科研還是醫(yī)療尤其是腫瘤免疫治療方面都早已投入使用，推動了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，影響深遠(yuǎn)。

2.1 在免疫阻斷療法中的應(yīng)用

在T細(xì)胞治療的過程中，免疫檢查點(diǎn)起到調(diào)節(jié)免疫的作用，但部分免疫檢查點(diǎn)的不正常表達(dá)和變化會阻礙T細(xì)胞作用，并且會利于腫瘤細(xì)胞逃逸擴(kuò)散，從而加重腫瘤疾病帶來的惡劣影響和治療難度。隨著對基因?qū)用嫜芯康倪M(jìn)一步深入的發(fā)展，目前如果能巧妙運(yùn)用CRISPR /Cas9基因編輯技術(shù)，使機(jī)體正常發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)，更好的修復(fù)自身抵抗腫瘤，也可以達(dá)到與傳統(tǒng)技術(shù)同樣的效果，并且操作更加簡單，表達(dá)效果也更迅速。舉個(gè)常見的例子，用sgRNA結(jié)合引導(dǎo)Cas9蛋白借助基因編輯電穿孔的方法進(jìn)入原代DNA中，從而達(dá)到敲除程序性死亡受體1基因（PD-1）的目的。PD-1基因被敲除后，表達(dá)減少，具體表現(xiàn)為不再對T細(xì)胞免疫抑制，被免疫檢查點(diǎn)影響的T細(xì)胞恢復(fù)原有的增殖和活性，提高T細(xì)胞的免疫功能，使腫瘤免疫治療效果更好。通過阻斷療法得到敲除了程序性死亡受體1基因的細(xì)胞，此時(shí)免疫負(fù)調(diào)節(jié)物對T細(xì)胞作用的阻斷途徑被切斷，CAR-T細(xì)胞的反應(yīng)能力有效提高，腫瘤治療效果增強(qiáng)[2]。

2.2 在過繼性細(xì)胞治療中的應(yīng)用

為了達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞這一目的，衍生出了通過導(dǎo)出免疫細(xì)胞，在體外被動刺激增活免疫細(xì)胞后重新導(dǎo)入人體的腫瘤治療方法。

腫瘤浸潤細(xì)胞療法是過繼性免疫治療的一種。近年，技術(shù)和設(shè)施的革新使研究進(jìn)程不斷加快，表現(xiàn)出了優(yōu)良的效果，使得這種基于外源基因修飾的過繼性免疫療法一度成為研究的主要方向。

在進(jìn)行TCR-T時(shí)，由于TCR分子自身的不唯一性，外源和內(nèi)源鏈隨機(jī)配對可能會形成雜合TCR分子，提高患自身免疫性疾病的可能性。因此針對本問題的研究重在控制鏈配對的過程，達(dá)到減少雜合分子產(chǎn)生的目的。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在這里的作用表現(xiàn)為編輯切割內(nèi)源性基因，使T細(xì)胞中只存在外源TCR基因，這種方法可以有效阻止雜合分子的產(chǎn)生和減小對機(jī)體的不利影響。

修飾外源基因的另一方法為CAR-T，雖然也可以達(dá)到過繼性細(xì)胞治療的目的，但存在多重限制，原因在于這個(gè)方法本身的原理是將病體的T細(xì)胞分離處理再重新回輸，而在此過程中又受到T細(xì)胞數(shù)量的限制和被機(jī)體系統(tǒng)排斥的影響，因此CAR-T雖有能力作到T細(xì)胞治療，但在實(shí)際的應(yīng)用中并不常見。早期實(shí)驗(yàn)證明如果將T細(xì)胞的內(nèi)源性TCR基因編輯清除后再作用，就可以得到可以有效避免GVHD發(fā)生的通用效應(yīng)T細(xì)胞。構(gòu)建方法即將TCR-T療法和電轉(zhuǎn)CRISPR編輯系統(tǒng)的方法相結(jié)合，把轉(zhuǎn)化物質(zhì)導(dǎo)入健康人體的T細(xì)胞中，從而得到具有較強(qiáng)抗腫瘤能力的同種異體通用效應(yīng)T細(xì)胞，這類細(xì)胞不單單只具有高效的體內(nèi)抗腫瘤活性，還可以減弱宿主自身系統(tǒng)和CAR-T細(xì)胞之間的相互排斥作用。另外，由于構(gòu)建通用效應(yīng)T細(xì)胞是針對CAR-T的缺陷而進(jìn)行研究的，因此它與CAR-T相反，能廣泛運(yùn)用于臨床治療，推動了基因編輯治療產(chǎn)業(yè)化實(shí)踐化的發(fā)展。

2.3 在抗體靶向療法中的作用

在腫瘤治療中常用的方法還有很多，例如利用腫瘤細(xì)胞表面會表達(dá)許多特殊抗原這一原理進(jìn)行治療，這些特殊抗原通常與正常抗原有較大的差異，因此研究者可依據(jù)這一差異性將抗原位點(diǎn)看作靶點(diǎn)，進(jìn)一步被機(jī)體自身系統(tǒng)抗體識別，從而消滅腫瘤細(xì)胞。

研究者通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在已經(jīng)發(fā)生了突變的小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中篩選出對癌細(xì)胞的增殖分化過程起重要作用的受體，根據(jù)抗體靶向治療的原理，針對這一類受體特異性結(jié)合。研究結(jié)果表明，經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理過的特殊受體相對應(yīng)的抗體抑制小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞增長的能力得到了顯著的提高。這種特殊的受體稱為Frizzled-5，由實(shí)驗(yàn)可以得到，F(xiàn)rizzled-5在抗體靶向療法中可能可以作為靶點(diǎn)，這一結(jié)論為免疫治療藥物的研究提供了很大的啟發(fā)。

抗體作用大體都是與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合后發(fā)揮保護(hù)作用，但這些不同的抗體在對系統(tǒng)的激活以及刺激免疫細(xì)胞對靶細(xì)胞的作用等方面仍存在差異，正是利用這種差異在不同方面腫瘤的不同應(yīng)用，研究者研發(fā)出了在抗體多樣化中占重要環(huán)節(jié)的，抗體類型轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換過程大致分為兩步，首先是利用B細(xì)胞特異性酶起始，在進(jìn)行不同lg基因間的類別轉(zhuǎn)換重組。在轉(zhuǎn)換重組過程中起著決定性作用的一步就是DNA雙鏈的斷裂。在過去，這種斷裂通常通過B細(xì)胞特異性酶來進(jìn)行啟動，哈佛的研究者們首次利用CRISPR/Cas9作用于小鼠多種細(xì)胞，有效的提高了抗體類型轉(zhuǎn)化的效率，從而實(shí)現(xiàn)了首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行抗體制備。此后，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成為高速高效簡便易操作抗體制備的主要途徑，在臨床治療和實(shí)驗(yàn)方面廣泛利用[3]。在腫瘤的抗體靶向治療中，抗原抗體結(jié)合片段因其自身的結(jié)構(gòu)較小，進(jìn)入組織更容易等特點(diǎn)而受到廣泛地運(yùn)用。

3.在遺傳性疾病中的作用

由于CRISPR/Cas9技術(shù)的在基因編輯方面顯著的優(yōu)越性，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，各領(lǐng)域便開始了利用該技術(shù)促進(jìn)本領(lǐng)域發(fā)展的相關(guān)研究，在農(nóng)業(yè)方面的作物培植到預(yù)防治療調(diào)控疾病等方面均已投入使用且得到了了較好的成果。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)為可編程系統(tǒng)，且能夠進(jìn)行基因組編輯，因此在遺傳性疾病的治療中體現(xiàn)了極大的優(yōu)勢。近年，研究者們已將CRISPR/Cas9技術(shù)運(yùn)用于癌癥和艾滋病等過去死亡率極高的遺傳病，并且取得了理論實(shí)驗(yàn)的成功，目前將此技術(shù)運(yùn)用于臨床治療的進(jìn)程也在穩(wěn)定的開展著，若投入使用成功，則能夠?yàn)楣タ似渌z傳性疾病提供極大的助力，具有很大的發(fā)展前景。

研究者們利用小鼠，通過CRISPR/Cas9技術(shù)在體內(nèi)設(shè)計(jì)構(gòu)建并且糾正了血友病B的模型，證明了CRISPR/Cas9技術(shù)在血液遺傳性疾病方面臨床治療的可行性。在擁有豐富的理論基礎(chǔ)后，研究者們開始投入實(shí)際的臨床使用。他們采取手段誘導(dǎo)iPSCs基因分類分化成為紅細(xì)胞，再對轉(zhuǎn)化出的紅細(xì)胞進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其可發(fā)揮正常紅細(xì)胞的作用，產(chǎn)生功能完善的β－球蛋白，從而可以減輕患者的貧血情況，解決地中海貧血癥所引起的病癥。CRISPR/Cas9技術(shù)同樣在另一種血液遺傳性疾病，鐮狀細(xì)胞性貧血癥中適用。研究者運(yùn)用相同的方法，通過CRISPR/Cas9技術(shù)改造患病者iPSCs中的HBB基因，基因編輯后，改造修復(fù)的iPSCs能夠分化到網(wǎng)織紅細(xì)胞階段，同樣能夠表達(dá)出與正常細(xì)胞功能相同的β－球蛋白[4]。

4.在G6PD缺乏癥方面的應(yīng)用

G6PD缺乏癥病因?yàn)槟軌蛘{(diào)控G6PD的基因發(fā)生了不正常的突變，因?yàn)樾Q豆可以誘導(dǎo)這種突變的發(fā)生，因此G6PD缺乏癥又被稱為蠶豆癥。根據(jù)G6PD酶的缺乏程度，能夠發(fā)揮的作用及障礙程度，可以將G6PD缺乏癥多種類型，不同等級的缺乏在治療過程中也存在差異。經(jīng)過去的臨床研究得到，調(diào)控G6PD基因的突變絕大部分為單基因突變，具有不定向不可控性，存在很多潛在危險(xiǎn)，可導(dǎo)致慢性溶血性貧血，并且很難進(jìn)行臨床治療。在早期實(shí)驗(yàn)中，研究者用CRISPR/Cas9敲除G6PD基因后，發(fā)現(xiàn)G6PD的表達(dá)顯著下降，這一結(jié)論為運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)治療G6PD缺乏癥的研究提供了很大的啟發(fā)。在此研究的基礎(chǔ)上，研究者又運(yùn)用基因編輯技術(shù)將匹配的sgRNA和Cas9蛋白注射入人胚胎中，進(jìn)一步證明了CRISPR/Cas9所引起的同源重組可以做到校正調(diào)控G6PD的基因發(fā)生的突變。

基因編輯研究雖然是一種新興的技術(shù)，但至今也已進(jìn)行了近60年的探索，開發(fā)了許多基因編輯技術(shù)。這些技術(shù)雖然也能做到按照人的主觀意愿改造基因，但與Cas9蛋白相比，還有明顯的不足，如只有Cas9蛋白才能做到對DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行共定位。除此之外，CRISPR/Cas9技術(shù)還具有特異性高，出錯(cuò)率低，人工設(shè)計(jì)操作較簡便和使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，具有很強(qiáng)的發(fā)展?jié)撃躘5]。

5.結(jié)語

由于CRISPR/Cas9技術(shù)具有高效、編輯速度快等特點(diǎn)，同時(shí)與其他基因編輯技術(shù)相比較為準(zhǔn)確和易操作，在臨床方面也運(yùn)用廣泛，為多種疾病的治療提供了助力和極大的推動作用。但不可忽視的是，現(xiàn)代生物對基因的研究仍有不足，任何的科技發(fā)展都是一把雙刃劍，如CRISPR /Cas9 基因編輯過程中出現(xiàn)的脫靶現(xiàn)象還沒有得到有效的解決，這使得基因編輯的效率受到了影響。應(yīng)通過增強(qiáng)Cass9蛋白的專一性及提高sgRNA的穩(wěn)定性等手段，改變靶標(biāo)效率，盡量減少脫靶現(xiàn)象的出現(xiàn)；同時(shí)在對生物尤其是人類的基因進(jìn)行改造時(shí)，不要一味只追求科技的進(jìn)步而忽視了倫理問題。綜上，基因編輯技術(shù)推動了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，在疾病治療中發(fā)揮了很重要的作用，但仍存在一定的缺陷，對CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究仍有很長的路要走。