一種氯化鐵誘導血栓生成的小鼠大腦中動脈遠端缺血模型

陳青芳，趙順英，董雯，龔婷，陳文濤，劉向榮

中國面臨著世界上最大的卒中挑戰，卒中在2018年導致157萬人死亡，是中國排名第三的死亡原因，其中70%為缺血性卒中[1-3]。腦或頸部動脈粥樣硬化性原位血栓形成、心源性栓子阻塞腦血管、血管狹窄均可導致急性腦血管阻塞，是引起急性缺血性卒中的常見病因[3]。臨床上大腦中動脈是缺血性卒中高發栓塞的血管。目前常用線栓堵塞小動物大腦中動脈制作栓塞模型，并根據是否將阻塞栓線拔出分為永久性缺血和再灌注兩種模型[4]。也可用不同方法將大腦中動脈的遠端血流阻斷，制作永久性大腦中動脈遠端缺血模型[5-6]。但以上模型偏重的是血流堵塞狀態，并無血栓形成，與疾病的實際狀態有一定差距。

本研究利用氯化鐵（ferric chloride，FeCl3）溶液的強氧化劑特性，誘導血管內皮細胞損傷，進而引起血管內血小板聚集形成血栓，使得小鼠大腦中動脈遠端栓塞（distal middle cerebral artery occlusion，dMCAO），充分模擬實際腦缺血的發病進程和狀態。小鼠dMCAO模型穩定且死亡率較MCAO模型低，為后續血栓形成和藥物溶栓研究提供支撐。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物及藥物 雄性C57BL/6J小鼠，24只，體重24.0±0.5 g（北京華阜康生物科技股份有限公司），適應性飼養在22～26 ℃、濕度50%～60%的環境中，自由獲取食水。本實驗實施遵照動物倫理要求。FeCl3（天津福晨化學試劑廠，中國）以生理鹽水配制成質量體積分數為10%的澄清溶液。

1.2 模型制作 小鼠隨機分為兩組：假手術組和腦缺血（dMCAO）組，每組12只小鼠。稱重后異氟烷吸入麻醉，左側俯臥位暴露右側顳肌，顱骨鉆孔。暴露右側大腦中動脈遠端，用浸潤10% FeCl3溶液的0.5 mm×0.5 mm濾紙貼于大腦中動脈遠端動脈分叉處3 min，除去濾紙，用生理鹽水清洗表面鹽溶液，覆蓋可吸收性明膠海綿，縫合。手術期間保持小鼠肛溫36～38 ℃。假手術組用生理鹽水替代FeCl3溶液進行處理。

1.3 腦表面及顳側血流量觀測 以FeCl3開始刺激的時間為0時刻，用多普勒散斑掃描儀記錄全腦表面血流量及大腦中動脈遠端的動脈血流量，每組6只小鼠。記錄手術前的基礎值、術后10 min、術后1 d和術后7 d的腦血流量以及顳側大腦中動脈遠端動脈血流量的變化情況。每只小鼠作自身前后對照，腦血流量百分比=（該時間血流量/基礎值血流量）×100%。

1.4 神經功能與運動感覺評價 造模后1 d、3 d、5 d、7 d對小鼠進行神經學功能評價和膠黏紙測試，每組6只小鼠，采用3種神經功能評分以全面評價小鼠在模型中的神經功能損傷情況，降低人為因素影響，包括：改良加西亞評分（modified Garcia score，mGS）[7]、改良神經損傷嚴重程度評分（modified neurological severity score，mNSS）[8]和15分神經學評估表（15-point neurological evaluation scale，NES）[9]。具體評分細則見表1。

膠黏紙測試方法：將0.5 cm×1 cm的紙片黏在小鼠左側前肢上，正常感知的小鼠會嘗試將紙片撕去。實驗中記錄小鼠第一次碰觸紙片及完全撕去紙片的時間，以評價其神經功能。每只小鼠術前訓練3 d，測試日及訓練日每天測試3次，每次間隔時間為15 min，避免小鼠疲勞或情緒抵抗。

表1 神經功能評分細則

1.5 腦組織梗死率測定 每組各取6只小鼠在造模后1 d取腦組織，在腦模具中切成1 mm厚的薄片，用2%的TTC溶液在37 ℃浸染15 min，TTC可使活細胞呈紅色，梗死區細胞呈白色，以此標記腦組織梗死區域。用ImageJ軟件進行數據分析，梗死率=（左側大腦正常組織體積-梗死側正常組織體積）/左側大腦正常組織體積。

1.6 免疫組織熒光染色 術后7 d取每組4只小鼠全腦制作冰凍切片，從前至后切成20 μm厚的切片。使用標記神經元的神經元核抗體（NeuN抗體，Millipore，美國）染色以確定腦組織損傷情況，用Vectra Polaris全自動定量病理成像系統（Perkin-Elmer，美國）采集圖像數據。用ImageJ軟件統計每只鼠6個層面的腦組織損傷，腦組織損傷率=各層（左半腦正常組織面積-梗死側半腦正常組織面積）之和/各層左半腦正常組織面積之和。采用離子化鈣結合適配分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）（和光純藥，日本）和CD16/32（BD Pharmingen，美國）及Iba1和CD206（R&D Systems，美國）免疫熒光共染，標記缺血區皮層M1、M2型小膠質細胞，評價術后腦組織缺血區域附近膠質細胞激活情況，用LSM710激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）采集圖像。實驗流程如圖1。

2 結果

2.1 實驗手術視野及操作 實驗手術前暴露顳側顱骨、暴露大腦中動脈血管遠端的操作視野（圖2A、圖2B）。大腦中動脈遠端暴露后可用多普勒散斑血流量儀檢測到清晰的動脈血流（圖2C）。用浸潤FeCl3溶液的濾紙處理動脈后，血流量顯著下降（圖2D、圖2E）。

圖1 實驗流程圖

圖2 手術視野圖

圖3 不同時間小鼠術側顳側動脈及腦表面血流量變化圖

2.2 術后不同時間腦血流量的變化 分別記錄FeCl3溶液處理前、處理后10 min、術后1 d和7 d的顳側血流量和腦表面血流量（圖3）。結果顯示FeCl3溶液處理可使大腦中動脈遠端動脈血流量下降，并引起腦表面大腦中動脈支配區域血流量減少。dMCAO組術后10 min顳側大腦中動脈遠端血流量平均下降至初始血流量的33.67%±6.66%（vs假手術組94.91%±1.46%，P<0.001），術后1 d和7 d維持在30%以下且持續下降（dMCAO組vs假手術組，1 d：29.78%±4.71%vs84.37%±2.93%；7 d：23.68%±3.22%vs77.37%±1.17%，均P<0.001）。dMCAO組大腦中動脈支配區域的腦表面血流量在術后10 min及術后1 d為初始值的37.80%±5.86%及38.32%±6.04%（vs假手術組81.58%±5.24%及81.88%±5.25%，均P<0.001），術后7 d可能由于側支循環的代償，腦表面血流量有所恢復，但仍與假手術組的差異有統計學意義（dMCAO組vs假手術組：73.71%±5.92%vs93.27%±1.56%，P=0.0156）。

2.3 術后腦組織梗死率及腦組織損傷 與假手術組相比，dMCAO組術后1 d出現明顯的腦組織梗死，主要集中于右側腦皮層區域。統計顯示，dMCAO組平均梗死體積為16.84%±2.15%，與假手術組（無梗死）相比差異有統計學意義（P<0.001）（圖4）。

術后7 d，dMCAO組腦組織損傷的面積百分比為9.81%±2.56%，顯著高于假手術組（無損傷），P=0.0086，表明該模型術后7 d小鼠神經元受損、腦組織損傷（圖5）。

2.4 神經學評分及膠黏紙測試 術前各項神經學評分和膠黏紙測試，dMCAO組與假手術組差異無統計學意義；術后1 d、3 d、5 d、7 d，dMCAO組與假手術組相比，3種神經學評分差異均有統計學意義。與假手術組相比，dMCAO組在術后1 d、3 d、5 d的膠黏紙測試中，撕去膠黏紙的時間差異有統計學意義（表2）。

2.5 腦組織膠質細胞表達 取小鼠腦組織切片標記CD16/32或CD206，與Iba1共染。Iba1和CD16/32標記缺血區皮層M1型小膠質細胞，Iba1和CD206標記M2型小膠質細胞。與假手術組相比，dMCAO組術后7 d梗死皮層附近M1型和M2型膠質細胞表達增加，出現大量M2型膠質細胞（圖6），表明該模型術后腦組織梗死區附近膠質細胞大量激活，可能與活躍的炎癥反應相關。

圖4 術后1 d小鼠腦組織梗死率

3 討論

急性缺血性卒中是全球死亡率高、致殘率高的重大疾病[10]，目前研究其病理機制的動物模型主要有大腦中動脈線栓模型、大腦中動脈遠端凝斷模型、光化學血栓模型和自身原位血栓模型。大腦中動脈線栓模型是經典的栓塞模型，可以很好地阻塞大腦中動脈遠端，與臨床血管閉塞部位近似度高，是經典的急性腦缺血模型[4]。大腦中動脈遠端凝斷模型[6]和本研究中的腦缺血模型均針對該血管的遠端造模，相對經典線栓模型而言，遠端造模的動物死亡率低，為模型成模后的長期存活提供了可能，可針對長期的生理病理變化、認知恢復和藥物藥理機制展開研究[11]。不過，大腦中動脈線栓模型和大腦中動脈遠端凝斷模型均沒有原位血栓形成，僅物理性地阻斷了血流，雖然有利于研究遠端組織的缺血缺氧機制，但無法滿足藥物溶栓、取栓或溶栓后血流變化等的相關研究。

光化學誘導血栓形成的血栓模型往往損傷的是以光照為中心的某個范圍，而且血管損傷和血栓最先出現在毛細血管、細靜脈和細動脈，其次才影響到大靜脈，最后受影響的才是大動脈，與臨床上的動脈血栓堵塞過程有較大差異[12-13]。自身原位血栓模型需要先用動物自體血制作符合目的血管直徑的血栓，再將血栓送到大腦中動脈或者大腦中動脈遠端，理論上能較好模擬腦缺血過程及狀態，但操作技術難度較大，對實驗設備要求高[14-15]。

本實驗應用氯化鐵誘導血栓的方法建立腦缺血模型，一方面滿足了腦缺血的目的，另一方面形成大腦中動脈遠端的血管內原位血栓，彌補了目前線栓模型和凝斷模型的沒有血栓、僅機械阻斷的不足，也突破了光化學血栓模型范圍性損傷的局限。且本實驗手術操作簡單便捷，所需設備常見，易形成統一標準化的實驗流程。

圖5 術后7 d小鼠腦組織損傷

表2 神經功能評分及膠黏紙測試結果

本實驗中，我們使用FeCl3溶液刺激大腦中動脈遠端血管形成穩定血栓，建立了較好的小鼠長期腦缺血模型。手術操作簡便，在刺激后10 min造成顳側大腦中動脈血流量和腦表面血流量下降并維持至術后7 d，術后1 d腦組織皮層有明顯梗死，且術后7 d仍有腦組織損傷。

本實驗進一步用mGS、mNSS和NES 3種神經學評分方法評價小鼠感覺和運動神經功能損傷，發現該血栓造成的腦缺血模型在術后1～7 d均有明顯的運動障礙和感覺或反射損傷，另外，該模型術后膠黏紙測試結果也與假手術組有差異。表明該模型可以形成小鼠腦功能損傷，包括運動和感覺功能的受損。另外，該模型在術后7 d可觀察到梗死區域附近膠質細胞的激活現象，M1、M2型膠質細胞大量出現，這一現象符合臨床和其他動物腦缺血模型研究中的炎癥變化特點[15-16]。

FeCl3溶液可誘導形成穩定的小鼠腦缺血模型，模型動物運動和感覺神經功能受損，大腦中動脈遠端及術側腦表面血流量降低，腦皮層出現組織梗死，梗死周圍可見膠質細胞表達上調。本研究建立了穩定的腦缺血模型，不僅達到了腦皮層缺血的實驗需求，而且形成了大腦中動脈遠端的血管內原位血栓，為后續藥物溶栓等研究提供了良好的動物模型和技術支撐。

圖6 術后7 d小鼠腦梗死周圍膠質細胞染色

【點睛】10%氯化鐵溶液誘導血栓生成可制作穩定的小鼠腦缺血模型。