急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者血漿miR-375 水平與預(yù)后的關(guān)系

陸 宏，陶 杰，李家宇

近年來，隨著我國人口老齡化進(jìn)程加快，急性冠狀動(dòng)脈綜合征 （acute coronary syndrome，ACS）發(fā)病率和死亡率逐年增加，且有年輕化發(fā)展趨勢［1-2］。隨著介入技術(shù)發(fā)展，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）已成為ACS 治療的主要方法之一［3］，但仍有部分患者發(fā)生主要心血管不良事件（MACE）［4］。 因此，探究預(yù)判ACS 患者PCI 術(shù)后預(yù)后的標(biāo)志物有著重要意義。 微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是一種由 18～22 個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼 RNA［5］。 目前多數(shù)研究報(bào)道 miRNA 與 ACS 發(fā)病或預(yù)后有關(guān)［6-7］，如miR-21 與 ACS 斑塊穩(wěn)定性有關(guān)［8］。 miR-375 作為miRNA 家族成員，已被報(bào)道可抑制Notch 信號通路表達(dá)［9］。 眾所周知，Notch 信號通路抑制可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加，加劇心臟肥厚和心肌纖維化［10］。 基于上述研究，本研究推測miR-375 靶向Notch 信號通路參與心肌細(xì)胞調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響ACS 患者預(yù)后。本研究通過分析miR-375 與ACS 患者預(yù)后的關(guān)系，以期為預(yù)防MACE 發(fā)生提供參考。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月至 2017年4月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受治療的206 例ACS 患者作為研究對象。 參照《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》［11］診斷 ACS。 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次確診為ACS；②接受 PCI 治療；③ACS 發(fā)病后 48 h 內(nèi)入院；④配合完成相關(guān)檢查；⑤簽署知清同意書。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①接受冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)治療；②不接受PCI治療；③伴有擴(kuò)張性心肌病、心瓣膜病、肥厚型心肌病；④伴有慢性阻塞性肺疾病、外周血管疾病、胸主動(dòng)脈瘤、腦卒中、自身免疫性疾病或惡性腫瘤等；⑤肝、腎功能異常；⑥高同型半胱氨酸血癥；⑦隨訪失聯(lián)。 206 例 ACS 患者中男 134 例，女 72 例；年齡29～69 歲，平均（56.28±9.21）歲。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 信息收集

收集所有患者年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、疾病史（高血壓史、高脂血癥史、糖尿病史等）、ACS 家族史、ACS 類型［ST 段抬高型心肌梗死（STEMI）、非ST 段抬高型心肌梗死（NSTEMI） 和不穩(wěn)定心絞痛（unstable angina，UA）］、血管病變位置及支數(shù)等信息。

1.3 血漿miR-375 水平檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測 ACS 患者血漿 miR-375 水平［12］。 分別抽取 ACS患者入院24 h 內(nèi)和PCI 術(shù)后7 d 空腹外周靜脈血，4 000 r/min 離心15 min，離心半徑為8 cm，提取離心后上清液。 將TRIzol 試劑加至裝有上清液試管中提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA 純度，若A260/A280 在1.8～2.1，則用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用PCR 儀擴(kuò)增cDNA，擴(kuò)增條件為 95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。 內(nèi)參為 3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），用 2-DDct 計(jì)算 miR-375 水平。 引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 隨訪與預(yù)后評價(jià)

采用復(fù)診和電話隨訪了解ACS 患者預(yù)后清況。患者出院后隨訪3年，每月1 次，末次隨訪時(shí)間為2020年4月 8 日。 本研究將隨訪中發(fā)生 MACE 定義為預(yù)后不良。 MACE 包括再發(fā)心肌梗死、 不穩(wěn)定心絞痛、支架內(nèi)再狹窄、靶血管血運(yùn)重建及心源性死亡等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用配對樣本t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。 采用受試者工作特征曲線（ROC）評價(jià)miR-375 診斷ACS 預(yù)后的效能，Kaplan-Meier 法繪制高miR-375 組和低miR-375 組患者生存曲線，Log-Rank 法進(jìn)行比較。采用Cox 回歸法分析影響ACS 預(yù)后的因素，限制性立方樣條擬合Cox 回歸分析miR-375 與ACS 預(yù)后的關(guān)系，R3.6.3 軟件繪制限制性立方樣條圖。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACS 患者預(yù)后清況

206 例 ACS 患者 PCI 術(shù)后有 71 例 （34.5%）預(yù)后不良，包括再發(fā)心肌梗死28 例（13.6%）、不穩(wěn)定心絞痛 15 例（7.3%）、支架內(nèi)再狹窄 15 例（7.3%）、靶血管血運(yùn)重建 9 例（4.4%）、心源性死亡 4 例（1.9%）。

2.2 PCI 術(shù)后血漿miR-375 水平變化

根據(jù)PCI 術(shù)后是否發(fā)生MACE，將ACS 患者分為預(yù)后不良組（n=71）和預(yù)后良好組（n=135）。 兩組PCI 術(shù)后血漿miR-375 水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；預(yù)后不良組PCI 術(shù)后血漿miR-375水平高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表 2 ACS 患者 PCI 術(shù)前后血漿 miR-375 水平比較

表 2 ACS 患者 PCI 術(shù)前后血漿 miR-375 水平比較

組別 術(shù)前 術(shù)后 t 值 P 值預(yù)后不良組（n=71） 4.35±0.79 3.28±0.66 10.039 ＜0.001預(yù)后良好組（n=135） 4.28±0.68 2.31±0.64 24.005 ＜0.001 t 值 0.665 10.121 P 值 0.507 ＜0.001

2.3 血漿miR-375 評價(jià)ACS 預(yù)后的效能

PCI 術(shù)后血漿 miR-375 診斷 ACS 預(yù)后 ROC曲線下面積、最佳截?cái)帱c(diǎn)和靈敏度、特異度分別為0.862（95%CI=0.807～0.906）、2.62 和 87.32%、74.81%，PCI 術(shù)前血漿miR-375 診斷 ACS 預(yù)后 ROC 曲線下面積、 最佳截?cái)帱c(diǎn)和靈敏度、 特異度分別為0.513（95%CI=0.443～0.583） 和 3.90 和 63.38%、23.70%，PCI 術(shù)后血漿 miR-375 診斷 ACS 預(yù)后的效能高于PCI 術(shù)前血漿miR-375，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=7.046，P＜0.001），見圖 1。

圖 1 血漿 miR-375 診斷 ACS 預(yù)后 ROC 曲線

2.4 兩組基線資料比較

根據(jù)PCI 術(shù)后血漿miR-375 診斷ACS 預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)，將患者分為高miR-375 組（＞2.62，n=96）和低 miR-375 組（≤2.62，n=110）。 兩組年齡、性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、ACS 家族史、ACS 類型、病變位置和病變支數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 3。

2.5 兩組生存清況比較

低 miR-375 組平均生存時(shí)間為35.25（34.62～35.88）個(gè)月，高于高 miR-375 組［24.22（22.04～26.40）個(gè)月］，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=81.614，P＜0.001）。見圖2。

表3 兩組基線資料比較

圖2 兩組生存曲線

2.6 影響ACS 預(yù)后的因素分析

將ACS 患者預(yù)后作為因變量，年齡、 性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、高脂血癥史、ACS 家族史、ACS 類型、病變位置、病變支數(shù)和miR-375 作為自變量，納入Cox 單因素回歸分析，結(jié)果顯示高脂血癥史、 糖尿病史、ACS 家族史、 病變位置和miR-375與 ACS 預(yù)后相關(guān)（P＜0.05）。 按納入標(biāo)準(zhǔn) P＜0.1 將年齡、高脂血癥史、糖尿病史、ACS 家族史、病變位置和miR-375 作為自變量納入Cox 多因素分析，結(jié)果顯示ACS 家族史和miR-375 是ACS 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表 4。

2.7 血漿miR-375 水平與ACS 預(yù)后的關(guān)系

采用限制性立方樣條擬合Cox 回歸法，對ACS 家族史進(jìn)行調(diào)整后分析血漿miR-375 水平與ACS 預(yù)后的關(guān)系。 通過比較不同節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)所對應(yīng)模型Akaike 信息準(zhǔn)則（AIC）值，確定節(jié)點(diǎn)個(gè)數(shù)為4 時(shí)所對應(yīng) AIC 值最小（AIC=628.938）。 分析結(jié)果顯示血漿miR-375 水平與ACS 預(yù)后明顯相關(guān)（χ2=87.37，P＜0.001），且呈線性關(guān)系（非線性檢驗(yàn)χ2=4.13，P=0.127）。 以 miR-375 診斷 ACS 預(yù)后的最佳截?cái)帱c(diǎn)為參考點(diǎn)，miR-375 ＜2.62 時(shí)，與miR-375=2.62 比較，發(fā)生預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)較低；miR-375＞2.62 時(shí)，發(fā)生預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)增加。 見圖3。

表4 Cox 回歸分析影響ACS 患者預(yù)后的因素

圖3 miR-375 與ACS 預(yù)后的限制性立方樣條圖

3 討論

傳統(tǒng)ACS 預(yù)后預(yù)測指標(biāo)多為C 反應(yīng)蛋白、血清胱抑素C 及全球急性冠狀動(dòng)脈事件注冊研究（GRACE）評分等，但上述指標(biāo)在ACS 預(yù)后評估中價(jià)值均有限。 何東旭等［13］研究顯示 C 反應(yīng)蛋白評價(jià)ACS 患者預(yù)后的ROC 曲線下面積僅為0.634，診斷效能有限。C 反應(yīng)蛋白在多數(shù)炎癥性疾病中均表達(dá)，單獨(dú)用來評價(jià)ACS 預(yù)后特異度較低。 血清胱抑素C和GRACE 評分在ACS 預(yù)后評估中的價(jià)值也有限。王革等［14］采用血清胱抑素 C 和 GRACE 評分評價(jià)ACS 患者預(yù)后，結(jié)果顯示兩者診斷 ACS 預(yù)后的ROC 曲線下面積分別為0.748 和0.679，診斷效能有限。 因此，還需探究診斷效能較高的生物標(biāo)志物用于ACS 預(yù)后評價(jià)。

MiR-375 位于人染色體 2q35 區(qū)域 Cryba 2 和Ccdc 108 基因片段上［15］。 目前關(guān)于 miR-375 報(bào)道越來越多，且已證實(shí)與肝細(xì)胞肝癌［16］、胃癌［17］、前列腺癌［18］及宮頸癌［19］發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)。 然而目前尚缺乏關(guān)于miR-375 與ACS 患者PCI 后預(yù)后關(guān)系的研究。本研究通過比較ACS 患者PCI 術(shù)前與術(shù)后血漿miR-375 水平，發(fā)現(xiàn) ACS 患者 PCI 術(shù)后血漿 miR-375 水平降低，預(yù)后不良組血漿miR-375 水平高于預(yù)后良好組，提示miR-375 可能參與了ACS 發(fā)病和進(jìn)展過程，檢測其水平有望預(yù)判ACS 預(yù)后；通過構(gòu)建 miR-375 診斷 ACS 預(yù)后的 ROC 曲線，發(fā)現(xiàn) PCI術(shù)后miR-375 診斷ACS 預(yù)后的ROC 曲線下面積、靈敏度、特異度分別為0.862、87.32%、74.81%，表明PCI 術(shù)后miR-375 診斷ACS 預(yù)后的效能較高，但特異度較低，可輔助評價(jià)ACS 預(yù)后；通過進(jìn)一步比較高miR-375 組和低miR-375 組患者生存清況，發(fā)現(xiàn)低miR-375 組平均生存時(shí)間高于高miR-375 組，進(jìn)一步證實(shí)本研究推測miR-375 參與了ACS 進(jìn)展，檢測其水平可反映ACS 預(yù)后；通過Cox 回歸法分析影響ACS 預(yù)后的相關(guān)因素，發(fā)現(xiàn)ACS 家族史和miR-375 是ACS 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；進(jìn)一步通過限制性立方樣條分析miR-375 與ACS 患者預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-375 與ACS 預(yù)后不良存在線性關(guān)系，且預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)隨其水平增加而增加。 上述結(jié)果表明miR-375 水平高的ACS 患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)予以密切觀察、隨訪，避免MACE 發(fā)生。

Notch 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與細(xì)胞凋亡、分化及增殖過程，對器官形成和形態(tài)有影響作用［20］。 心肌細(xì)胞損傷后Notch 信號激活可發(fā)揮保護(hù)作用［10］。 此外，Notch 信號還與血管內(nèi)皮損傷后引起的血管內(nèi)再狹窄有關(guān)，Notch 1 信號激活后可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，通過上述機(jī)制參與新生內(nèi)皮增殖過程，進(jìn)而促使血管再狹窄發(fā)生［21-22］。 然而 miR-375 可通過調(diào)控Notch 信號通路參與 P19 細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化［10］。 本研究推測miR-375 通過Notch 信號通路，一方面調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡、分化及增殖過程，進(jìn)而影響心肌纖維化和心肌肥厚，另一方面參與血管內(nèi)再狹窄過程。 上述病理機(jī)制推測仍需實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步闡明。基于上述推測，檢測miR-375 水平可能有助于了解心肌細(xì)胞凋亡或纖維化等程度，進(jìn)而反映ACS 患者預(yù)后。

本研究不足之處，一是單中心研究，難免因地域問題對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定偏倚；二是未能動(dòng)態(tài)評估ACS 患者血漿miR-375 水平；三是未開展基礎(chǔ)研究闡明miR-375 影響ACS 預(yù)后不良的病理機(jī)制。下一步將針對不足進(jìn)行補(bǔ)充，充實(shí)本研究內(nèi)容。

綜上所述，ACS 患者PCI 術(shù)后血漿miR-375 水平高提示預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)較高，檢測PCI 術(shù)后ACS 患者血漿miR-375 水平有助于了解預(yù)后，避免MACE 發(fā)生。