LC-MS/MS法同時快速檢測牛肉中12種β-受體激動劑的應用研究

張洋

β-受體激動劑，俗稱瘦肉精，不是某一種特定的藥物，而是一類藥物，能夠促進瘦肉生長、抑制肥肉生長。當它們以超過治療劑量5-10倍的用量用于家畜飼養時，即有顯著的營養“再分配效應”，促進動物體蛋白質沉積、促進脂肪分解抑制脂肪沉積，能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉化率，因此曾被用作牛、羊、禽、豬等畜禽的促生長劑、飼料添加劑。[1-3]

但瘦肉精用量大、作用的時間長、代謝慢，所以在屠宰前到上市，在動物體內的殘留量都很大。這個殘留量通過食物進入人體，就使人體漸漸地中毒，如果一次攝入量過大，就會出現異常的生理反應，因此而被禁用。人若食用含瘦肉精的肉類后會出現頭暈、惡心、手腳顫抖、心跳加速甚至心臟驟停致昏迷死亡，特別對心律失常、高血壓、青光眼、糖尿病和甲狀腺機能亢進等患者有極大危害。[4-7]

在中國，通常所說的“瘦肉精”則是指鹽酸克倫特羅。它曾經作為藥物用于治療支氣管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用。其它類似藥物還有沙丁胺醇和特布他林等，都因為對人體健康危害過大，造成安全隱患，而在全球遭到禁用。在2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，農業部分別下發文件禁止食品動物使用β-受體激動劑類藥物作為飼料添加劑（農業部176號、193號公告、1519號條例）[8-12]。

因為能夠促進瘦肉生長、抑制動物脂肪生長，瘦肉精讓豬、牛、羊等牲畜的瘦肉率提高，帶來更多經濟價值，國內養殖戶不顧農業部的規定，在飼料中摻入過量瘦肉精，給市場上的肉類食品帶來了嚴重的安全隱患，所以研究出科學、高效、快速、準確的檢測方法十分必要。

目前常用的β-受體激動劑檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜質譜聯用法（GC/MS）、酶聯免疫法（ELISA）和液相色譜串聯質譜法（LC/MS/MS）。其中HPLC法靈敏度較低，不能滿足痕量檢測要求[13-15];GC/MS法除了需要大量的前處理步驟，還要求進行衍生化操作，較為繁瑣;ELISA法雖然操作簡單，但極容易出現假陽性情況，定性結果的準確性較差;只有LC/MS/MS法具有高效的分離能力和準確的定性定量能力，被廣泛使用，但此法也因為復雜耗時的前處理而被詬病[16]。因此建立一種科學、高效、快速、準確的檢測方法十分必要。

材料與方法

儀器與試劑

儀器名稱：NexeraX2超高效液相色譜和8045電噴霧三重四級桿質譜儀（日本島津）、ULPHW-I超純水機（上海優普）、MTN-2800W氮吹濃縮儀（德國AUTO Science公司）、超聲波清洗機（昆山潔力美）、H1850R冷凍離心機（湘儀儀器）、TG16-WS高速離心機（湘儀儀器）、VM-D渦旋混合器（上海皓莊儀器）、JY2002百分之一電子天平（舜守恒平儀器）、肉類絞碎機（嘉廚食品機械）、ATX224萬分之一電子天平（日本島津）;儀器經校準檢定合格后方可使用。

標準溶液名稱：實驗所用β-受體激動劑類標準品：鹽酸克倫特羅（Clenbuterol）、萊克多巴胺 （ Racto pamine）、沙丁胺醇（Salbutamol）、特布他林（Terbutaline）、西馬特羅（Cimaterol）、氯丙那林（Clorprenaline）、溴布特羅（Brombuterol）、齊帕特羅 （Zilpaterol）、噴布特羅（Penbutolol）、馬布特羅（Mabuterol）、妥布特羅（Tulobuterol）、非諾特羅（Fenoterol）采購于曼哈格公司。

同位素內標克倫特羅-D9 （Clenbuterol-D9）、萊克多巴胺-D3 （Ractopamine-D3）、沙丁胺醇-D3（Salbutero1-D3），購于Dr .Ehrenstorfer公司。

實驗試劑與耗材：乙腈（上海安譜公司，色譜純）、甲醇（上海安譜，色譜純）、乙酸（山東西亞，色譜純）、甲酸（山東西亞，色譜純）、無水硫酸鎂（國藥集團，分析純）、無水硫酸鈉（國藥集團，分析純）、乙酸銨（國藥集團，分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（國藥集團，分析純）、C18填料（天津博納艾杰爾）， 粒徑40-60μm、PSA填料（天津博納艾杰爾）， 粒徑40-60μm、GCB填料（天津博納艾杰爾），粒徑40-60μm;

方法

實驗色譜和質譜條件

色譜條件為：色譜柱： C18色譜柱， 規格2.1×100mm，粒徑1.9μm;柱溫：32℃;進樣體積：2μL;流速：0.3mL/min;流動相A是體積濃度為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液[17]，洗脫梯度，洗脫條件見表1;所述初始流動相是體積比為9：1的0.1%甲酸水溶液和乙腈的混合液;

質譜條件為：霧化氣流速：3.0L/min;干燥氣流速：10.0L/min;加熱氣流速：10.0L/min;DL管溫度250℃[18];加熱氣溫度：350℃;接口電壓：4000V;離子源類型：電噴正離子模式;掃描方式：多反應監測掃描;氦氣作為碰撞氣，霧化氣和加熱氣均為氮氣，干燥氣為潔凈空氣，各個物質及內標物的主要質譜參數見表2：

標準溶液的制備

混合標準工作溶液：分別稱取10mg的鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、西馬特羅、氯丙那林、溴布特羅、齊帕特羅、噴布特羅、馬布特羅、妥布特羅、非諾特羅12種β-受體激動劑，用甲醇溶解并定容至100mL，此貯備液濃度為100mg/L，得到混合標準貯備液，用0.1%甲酸水-乙腈（9：1）來稀釋混合標準貯備液，配制混合標準工作溶液，濃度梯度為0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，且每個濃度梯度中均加入有6ng的同位素內標物， 同位素內標物由質量比為1：1：1的克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D3和沙丁胺醇-D3組成。