肉牛飼用復合益生菌組合的篩選試驗

左秀峰，左秀麗，楊東英，左可吉

（1.莒南縣畜牧發展促進中心,山東 臨沂 276600；2.德州學院，山東 德州 330000；3.莒南縣文疃鎮防檢所，山東 臨沂 276600）

20世紀80年代以來,青貯秸稈生產推動了養牛業規模化發展，但是散戶因場地小、無技術難以實施。肉牛強度育肥存在飼料消化不全、酸中毒、秸稈利用率低和藥殘等問題。養殖業減藥行動推動了科研部門潛心研發替抗減抗新型微生態制劑，促進了肉牛產業的發展。益生菌作為對宿主有益的活性微生物逐漸應用于食品安全領域。如何簡便易行地利用益生菌發酵秸稈，生產低成本牛飼料，關系到節糧養牛業的高效發展。本課題優選出最佳肉牛飼用復合益生菌組合，確定了精補料中最佳添加比例。

1 材料與方法

1.1 肉牛飼用復合益生菌的篩選

根據農業農村部蘭州獸藥研究所研究，選擇可用于生產微生態制劑的微生物，即酵母菌、芽孢桿菌、糞腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和乳酸鏈球菌等6種微生物，在前期研究的基礎上，與德州學院、江西農業大學和國家肉牛體系臨沂實驗站聯合篩選出酵母菌、乳酸糞腸球菌和芽孢桿菌3種益生菌，經不同組合比例、按一定工藝研制出4種飼用復合益生菌組合，代號分別為 I、II、III、IV。

采用體外培養方法，研究不同飼用復合益生菌組合對魯西黃牛改良的利雜牛瘤胃體外發酵的影響。體外培養試驗設5個組，不添加益生菌的基礎日糧為對照組，4個試驗組分別添加I、II、III和IV號飼用復合益生菌，在精補飼料中的添加量均為180 mg/kg。

1.1.1 試驗動物及日糧組成。選用2頭體重為（276±13）kg安裝有永久性瘤胃瘺管的健康利雜黃牛，以供瘤胃液的采集測試。試驗期間每天飼喂2次（8∶00和18∶00）,自由飲水。TMR飼料為玉米-豆粕-青貯玉米秸日糧，按照肉牛飼喂量的1.3倍維持需要配制，精粗比為59∶41,基礎日糧組成和營養水平見表2。

表2 基礎日糧組成及營養水平

每千克預混料含維生素A20萬單位、維生素D33萬單位、維生素 E600IU、銅 300 mg、鐵 1900 mg、錳1180 mg、鋅 1460 mg、硒 20 mg、碘 30 mg、鈷 9 mg、鈣100～200 g、磷60～90 g及食鹽15%。

1.1.2 體外培養試驗。①產氣量。每隔0.5 h記錄注射器抽取的氣體量，記錄完后排干凈，累計培養24 h的總產氣量。②瘤胃液pH值。培養24 h后立即用微電腦pH-EC-TDS測定儀（青島翌宏儀器有限公司）直接測定。③瘤胃液NH3-N濃度。參照馮宗慈比色法進行測定。④瘤胃液菌體蛋白（MCP）的測定。取經預處理去除原蟲和飼料大顆粒的上清液20 mL，以16000 r/min離心28 min，棄去上清液，沉淀的細菌部分加入15 mL 10%三氯乙酸溶液。混勻，再以4000 r/min離心13 min，取沉淀物加入5%氫氧化鈉溶解，然后稀釋至40 mL。此稀釋液又經4000 r/min離心15 min，取上清液在紫外分光光度計上用280 nm和260 nm波進行比色，應用以下公式求得細菌蛋白質含量：

細菌蛋白含量 （mg/mL）=(1.45×D280-0.74×D260)×稀釋倍數。

瘤胃液VFA濃度按照賽默飛氣相色譜法進行測定。⑤采用Excel軟件和Spss16.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析和多重比較顯著性檢驗。

表3 飼用復合益生菌組合制劑對培養液產氣量、pH值、MCP含量、NH3-N濃度和干物質降解率的影響

1.2 II號肉牛飼用復合益生菌飼喂添加試驗

1.2.1 試驗地點。沂水縣宗盛牛場。

1.2.2 試驗動物及設計。選擇出生日期接近（3月齡以上）、體重相近的健康犢牛24頭，采用單因子隨機分成4個試驗組，每組6頭。試驗從2018年9月1日開始，試驗期30 d，飼養環境一致。

1.2.3 試驗動物日糧及飼養管理。所有試驗犢牛在試驗期每日人工哺乳牛奶1 kg，飼喂相同基礎日糧。日飼優質苜蓿干草3 kg、精料2 kg。試驗分為4組，3個試驗組分別按照精料量添加0.05%、0.10%和0.20%的II號肉牛飼用復合益生菌，接種拌料，35～45℃發酵3 d飼喂，對照組不添加。每日飼喂2次，自由飲水。精飼料的主要營養成分見表4。

表4 精飼料主要營養成分（單位：%）

1.2.4 測定生產性能指標。①測定指標。分別在試驗開始和試驗結束日早晨空腹稱重，測定體尺指標，每日飼喂時觀察犢牛的糞便和尿液，根據以下標準評分記錄腹瀉情況。

腹瀉頻率 （%）=（腹瀉頭數×腹瀉天數）/（試驗頭數×正試期天數）×100；

糞便指數=糞便評分之和/總頭數。

試驗期內每日對每頭犢牛的糞便進行打分，當犢牛糞便評分＞2時記為一個腹瀉日；當糞便評分為4時，按照牛場治療方案進行治療；每頭犢牛腹瀉1 d記腹瀉1次。②評分標準。1分正常，糞便呈條形或柿餅狀，稍有糞味；2分輕度軟糞，糞便松軟成形，糞臭輕；3分中度腹瀉，糞便呈糊粥狀，不成形，酸臭味，糞水無分離[1]；4分嚴重腹瀉，糞便呈液狀不成形，糞水有分離，酸臭難聞。

表5 飼喂不同含量II號肉牛飼用復合益生菌對犢牛生長性能的影響（單位：kg,cm，kg/d）

由表6和表7得知，飼喂不同含量II號肉牛飼用復合益生菌精料組的各組犢牛均有腹瀉，但是腹瀉程度有一定差別，其中對照組腹瀉頻率和糞便評分最高，0.1%組最低。整體來看，本次選擇的試驗期各組腹瀉發生的概率都不高。楊東英教授指出，乳酸菌在體內產生的弱酸環境對致病性大腸桿菌、沙門氏菌和葡萄球菌等均有不同程度的抑制作用。枯草芽孢桿菌活菌制劑具有治療犢牛和生產奶牛細菌性腸道疾病的作用，觀察期間未發現動物不良反應[2]。本試驗結果顯示，添加不同含量肉牛飼用復合益生菌對犢牛腹瀉都有很好的抑制作用。

表6 飼喂不同含量II號肉牛飼用復合益生菌對犢牛腹瀉的影響

表7 不同益生菌組對犢牛腹瀉評分

2 實驗結果與分析

2.1 生化指標

2.1.1 不同飼用復合益生菌組合體外培養產氣量、pH值、MCP含量、NH3-N濃度和干物質降解率。由表3可知，添加I、II、III、IV飼用復合益生菌組合和對照組的培養液pH值均在正常范圍內。添加I、II、III飼用復合益生菌組合的24 h總產氣量比對照組有顯著提高（P＜0.05），各處理組間差異不顯著（P＜0.05），但是 II號飼用復合益生菌組合的產氣量最高為170.40 mL；I、II號飼用復合益生菌組合產生的微生物蛋白含量極顯著高于其他組（P＜0.01），其中II號飼用復合益生菌組合的微生物蛋白含量最高達270.38 mg/100 mL，而且顯著高于 I、III、（P＜0.05）。 I、II、III飼用復合益生菌組合產生的氨態氮濃度極顯著低于對照組和第IV號組合（P＜0.01），IV 號組合顯著低于對照組（P＜0.05）；II、III號飼用復合益生菌組合的干物質降解率極顯著高于對照組（P＜0.01）。

2.1.2 瘤胃液揮發性脂肪酸濃度。對照組、I、II、III、IV總 VFAmmol/L 分 別 為 139.65 ±0.17、144.38 ±0.97、146.01±0.62、145.88±0.11 和 140.71±0.13，II組顯著高于對照組。添加飼用復合益生菌能夠穩定瘤胃內環境，促進瘤胃發酵功能改善。從生化指標分析以II號飼用復合益生菌組合 （50%酵母菌+25%乳酸糞腸球菌+25%芽孢桿菌）效果最佳。

2.2 生產性能

由表5可知，試驗開始時各組犢牛體尺、體重指標各組差異不顯著 （P＞0.05）。飼喂復合益生菌精料后，0.05%組與對照組差異不顯著（P＞0.05），0.1%組和0.2%組體高極顯著高于對照組 （P＜0.01），顯著高于0.05%組（P＜0.05）；0.1%組和 0.2%組胸圍顯著高于對照組（P＜0.05）。試驗期0.1%組日增重最高，顯著高于對照組 （P＜0.05），高出 0.23 kg/d,其次 0.2%組和0.05%菌組，0.05%組較對照組增重率提高17.30%。試驗結束后 0.1%組和0.2%組體重同樣顯著高于對照組（P＜0.05），其他各組之間差異不顯著（P＞0.05）。研究表明，添加0.1%的II號肉牛飼用復合益生菌（50%酵母菌+25%乳酸糞腸球菌+25%芽孢桿菌）可顯著提高犢牛瘤胃消化率和全消化道消化率，糞便細膩松軟無臭味，飼喂肉牛飼用復合益生菌精料對犢牛生長發育有顯著提高，0.1%組在日增重上顯著高于其他各組。

3 結論

第一，創新模擬瘤胃菌群環境，運用篩選益生菌的原理與技術優選出肉牛飼用復合益生菌組合（50%酵母菌+25%乳酸糞腸球菌+25%芽孢桿菌），飼料干物質降解率、MCP含量、產氣量和總VFA濃度顯著提高；顯著降低NH3-N濃度，瘤胃液pH值穩定。

第二，犢牛按精補料添加0.1%肉牛飼用復合益生菌，能夠增強瘤胃消化粗纖維、木質素和粗蛋白的能力，緩解酸中毒，對降低犢牛腹瀉有很好的抑制作用；糞便細膩無過料，臭味輕；可顯著提高犢牛生長發育性能，體尺、胸圍、體高和日增重顯著提高。日增重提高0.24 kg/d，腹瀉率降低70%，增強了抗病力。

第三，肉牛飼用復合益生菌提高了非常規粗飼料的利用率，可提高經濟效益10%以上，干物質排放量減少3.5%，屠宰檢測無藥殘。該成果可促進飼料生產新舊動能轉換和節糧養殖業增效。