鴨疫里默氏桿菌和鵝細(xì)小病毒混合感染的實驗室診斷

袁 標(biāo) ，張 海 ，鄧珊珊 ，藺俐仲 ，袁 林 ，羅登蕎 ，景書灝 ，徐春志 ，劉 霞 ，楊 源 ，劉 艷

（1.貴陽市息烽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽 551100；2.貴陽市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽550081；3.貴陽市清鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽 551400；4.貴陽市草地站，貴州 貴陽 550081；5.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550001）

近年來貴州大力發(fā)展養(yǎng)殖業(yè)，其中生態(tài)家禽為農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命重點發(fā)展的特色產(chǎn)業(yè)之一。生態(tài)家禽養(yǎng)殖規(guī)模快速發(fā)展，但是由于部分養(yǎng)殖場養(yǎng)殖技術(shù)跟不上、養(yǎng)殖密度增大等原因，鴨場經(jīng)常發(fā)生各類疾病，如病毒性疾病、細(xì)菌性疾病和寄生蟲病等，其中鴨疫里默氏桿菌病和鵝細(xì)小病毒病，已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌引起的一種急性、敗血性、接觸性傳染病[1]。鴨疫里默氏桿菌屬于里默氏桿菌屬黃桿菌科，革蘭氏染色呈陰性，短桿狀，美蘭染色為兩極濃染，不產(chǎn)生芽孢[2]。鴨疫里默氏桿菌主要易感動物為雞、鴨、火雞等，對2～3周齡雛鴨最易感染。發(fā)病家禽的主要病理變化為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎。我國自20世紀(jì)80年代首次報道該病以來，目前已在江蘇、湖南、湖北等地相繼發(fā)生。鵝細(xì)小病毒病是由鵝細(xì)小病毒引起的一種急性傳染病。鵝細(xì)小病毒是細(xì)小病毒科單股線狀無囊膜DNA病毒，可引起鴨發(fā)生下痢、跛行、后肢癱瘓等臨床癥狀[3]。該病自1971年在法國首次報道，2014年后在我國廣西、江蘇、廣東、福建等水禽養(yǎng)殖集中區(qū)域呈現(xiàn)流行態(tài)勢[4]。貴州省某鴨場購進 7日齡雛鴨10000只，飼養(yǎng)至9日齡后鴨群逐漸出現(xiàn)被毛散亂、精神沉郁、行動遲緩、站立不穩(wěn)和跛行等臨床癥狀，并有大量雛鴨死亡，雛鴨15日齡時已死亡4000余只。剖檢病死鴨可見其肝臟腫大呈灰白色、心包膜纖維素性滲出，部分患病鴨脾臟腫大呈大理石樣，腸系膜出血，腸腔腫脹。鴨群6日齡時使用益康泰、恩諾沙星。7日齡接種禽流感H9+新城疫二聯(lián)滅活疫苗，8日齡投喂氟苯尼考、雙黃連口服液、黃金維他，11日齡接種禽流感H5N1-8+H7二價滅活疫苗。18日齡注射益康泰、青霉素、鏈霉素，取得了明顯效果。為了進一步確診該養(yǎng)鴨場雛鴨異常死亡的病因，采用了流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢、細(xì)菌分離鑒定、細(xì)菌PCR檢測、藥敏試驗和病毒核酸檢測等實驗室診斷方法，以期為后期防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 病料

選擇患病雛鴨5只，剖檢并無菌采集其心包液、肝臟組織、腦組織樣本。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

2×TaqPCR MasterMix、DNA Marker DL2000、細(xì)菌基因組提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司；DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、禽流感病毒通用型核酸檢測試劑盒、新城疫病毒核酸檢測試劑盒、鴨圓環(huán)病毒核酸檢測試劑盒、鵝細(xì)小病毒核酸檢測試劑盒、鴨坦布蘇病毒核酸檢測試劑盒、鴨肝炎病毒核酸檢測試劑盒均購自北京世紀(jì)元享公司；新生牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；試驗所用的抗菌藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；巧克力培養(yǎng)基為實驗室自制。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在二級生物安全柜中無菌接種5只受檢鴨的心包液、肝臟組織于巧克力瓊脂平板，分別置于37℃培養(yǎng)箱中進行有氧和厭氧恒溫培養(yǎng)18 h。

1.4 病毒核酸檢測

在二級生物安全柜中，取病鴨內(nèi)臟及腦組織樣本，加入適量PBS緩沖液，研磨勻漿后，離心取上清，采用RNA/DNA提取試劑盒分別提取病毒RNA/DNA，進行禽流感病毒、新城疫病毒、鴨圓環(huán)病毒、鵝細(xì)小病毒、鴨坦布蘇病毒和鴨肝炎病毒核酸檢測。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)

經(jīng)37℃無氧過夜培養(yǎng)的巧克力瓊脂平板，菌落表面光滑濕潤、邊緣整齊、半透明呈露滴狀。挑取單個菌落進行純化培養(yǎng)，經(jīng)革蘭氏染色，鏡檢顯示分離菌為革蘭氏陰性短小桿菌。初步判斷為鴨疫里默氏桿菌。

2.2 細(xì)菌PCR鑒定

根據(jù)鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)基因設(shè)計特異性引物，預(yù)擴增片段為663 bp。挑取純化培養(yǎng)的單個菌落到含5%新生牛血清的液體培養(yǎng)物中，震蕩過夜培養(yǎng)。參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總DNA，加樣進行PCR擴增，采用25 μL反應(yīng)體系進行PCR擴增，擴增程序為95℃預(yù)變性3 min，然后進入95℃變性45 s、54.1℃退火45 s和72℃延伸45 s的35次循環(huán)，最后72℃再延伸10 min。取PCR擴增產(chǎn)物8 μL，1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，鴨疫里默氏桿菌陽性對照和分離菌樣本在663 bp處均出現(xiàn)特異性條帶，說明本次厭氧培養(yǎng)后分離得到的細(xì)菌為鴨疫里默氏桿菌。

2.3 細(xì)菌藥敏試驗

藥敏試驗采用藥敏紙片瓊脂擴散法，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會 （Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的標(biāo)準(zhǔn)進行，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按NCCLS2010年標(biāo)準(zhǔn)進行。對分離得到的鴨疫里默氏桿菌分離株進行藥敏試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌對頭孢呋辛、頭孢唑啉、氨芐西林、羧芐西林、萬古霉素、慶大霉素、新霉素和丁胺卡那等抗菌藥物均呈不同程度的耐藥性，而對頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢拉定、哌拉西林、氧氟沙星、諾氟沙星和米諾環(huán)素等抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性。

2.4 病毒核酸檢測結(jié)果

對5份病料組織進行禽流感病毒、新城疫病毒、鴨圓環(huán)病毒、鵝細(xì)小病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨肝炎病毒核酸檢測，其中禽流感病毒、新城疫病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨坦布蘇病毒、鴨肝炎病毒核酸檢測結(jié)果為陰性，5份樣本均擴增出與鵝細(xì)小病毒預(yù)期相符的目的片段，結(jié)果見圖2。提示鴨群存在鴨圓環(huán)病毒感染。

3 結(jié)論

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、病理剖檢、細(xì)菌分離鑒定、細(xì)菌PCR檢測、藥敏試驗和病毒核酸檢測等實驗室方法進行診斷，確診引起該養(yǎng)鴨場雛鴨異常死亡的病因為鴨疫里默氏桿菌和鵝細(xì)小病毒混合感染。藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，分離菌對頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢拉定、哌拉西林、氧氟沙星、諾氟沙星和米諾環(huán)素等抗菌藥物呈現(xiàn)良好的敏感性。

4 討論

鴨疫里默氏桿菌血清型眾多，據(jù)報道已經(jīng)鑒定的血清型有21種，國內(nèi)主要流行的血清型是1型、2型和10型[5]，不同血清型之間的交叉保護效果較低，因此使用疫苗免疫后，常常也會有該病的流行。由于缺乏有效的疫苗進行預(yù)防，臨床上治療鴨疫里默氏桿菌病主要以抗生素為主，但是近年來隨著養(yǎng)殖量的增加和抗生素的濫用，有的養(yǎng)殖場出現(xiàn)了多重耐藥的情況，所以合理使用敏感抗生素，對治療和預(yù)防鴨疫里默氏桿菌病顯得十分重要。

臨床上鵝細(xì)小病毒病沒有特效的治療藥物和疫苗，因此早期的臨床診斷非常重要。臨床上可以根據(jù)臨床癥狀和剖檢病變，進行初步判斷，通過實驗室診斷進行病原確診。鵝細(xì)小病毒的實驗室診斷方法主要有病毒分離鑒定、免疫組化試驗、瓊脂擴散試驗、PCR檢測、熒光定量PCR檢測等。由于病毒分離鑒定、免疫組化試驗和瓊脂擴散試驗耗時較長，并且操作繁瑣。PCR檢測和熒光定量PCR檢測耗時相對較短，是實驗室診斷常用的檢測方法。

由于鴨疫里默氏桿菌病和鵝細(xì)小病毒病沒有特效的疫苗和治療藥物，因此只有通過加強生物安全防控措施來防止鴨群出現(xiàn)感染。首先必須做好引種檢疫和合群前隔離工作，不在有鴨疫里默氏桿菌病和鵝細(xì)小病毒病流行的區(qū)域和養(yǎng)殖場引種，做好禽流感、新城疫等相關(guān)疫病的基礎(chǔ)免疫工作和免疫抗體監(jiān)測。加強養(yǎng)殖場生物安全體系建設(shè)和飼養(yǎng)管理水平，加強環(huán)境衛(wèi)生消毒和雛鴨保暖工作，合理使用抗生素和消毒藥物。