美極梅奇酵母T-2灌胃對小鼠的毒性作用

艾丹，常若葵，張斌，于瑋瑋，王遠宏，*

（1.天津農學院園藝園林學院，天津300384；2.天津農學院工程技術學院，天津300384）

近年來，隨著生活水平的提高，人們對水果的需求與日俱增，水果采后腐爛問題也變得愈發凸顯，而通過微生物控制水果采后病害作為化學保鮮劑的良好替代品，已成為當下研究的熱點和發展趨勢，且與傳統化學農藥相比，生物防治具有良好的環境相容性和生物安全性[1]。其中，酵母菌因其遺傳穩定、抑菌譜廣、對營養條件要求低、生長迅速、能夠在水果表面定殖等諸多優點而受到廣泛關注[2-3]。

本研究中的美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）是從藍莓果實上分離篩選出的酵母菌種，該酵母菌不僅可以對水果采后灰霉菌和鏈格孢菌有較強的抑制作用，還可以有效抑制青霉和芽枝霉菌，是一株具有開發潛力的采后生防酵母菌，鑒于生防酵母菌作為活體生物殺菌劑，對水果采后病原菌的抑制往往建立在菌株安全的基礎上，因此其安全性是影響公眾接受度的最主要因素[4]。因此，對生防菌的安全性進行評估，特別是就生防菌株本身及其代謝產物對動物和人體的毒性進行評價尤為必要[5-8]。而目前針對該酵母菌安全性的研究還未見報道，本文以昆明種鼠為實驗材料，參照GB 15193.1-2014《食品安全國家標準食品安全性毒理學評價程序》[9]，測定了不同劑量美極梅奇酵母菌T-2發酵液對大鼠的急性經口毒性、遺傳毒性試驗及30 d經口毒性的影響，對其進行安全性評價，為今后新資源的開發和商業化實踐生產提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株及實驗動物

菌株：酵母菌T-2由天津農學院植物病理實驗室從藍莓果實分離并保存，經初步鑒定為梅奇酵母屬（Metschnikowia sp.）。

實驗動物：清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，年齡在3～4個月之間，體重18 g～20 g；清潔級成年大鼠，雌雄各半，體重180 g～220 g。供試鼠及飼料均購于中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。飼養室溫度20℃～25℃，自由攝食和飲水[10]。鼠籠墊料及飲水壺每2 d更換并進行清洗，以保持清潔。

1.2 藥劑、試劑和儀器

AMES試劑盒：北京匯智泰康醫藥技術有限公司；環磷酰胺：上海源葉生物科技有限公司；吉姆薩染液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered salin，PBS）、蘇木素、伊紅：Solarbio公司；品紅、酒精、甲醇、甲醛、二甲苯：分析純，天津風船化學試劑有限公司；分化液、返藍液：廣州市凱秀貿易有限公司。

AX224ZH/E型電子天平：奧豪斯儀器（常州）公司；shinva高壓滅菌鍋：山東博科生物產業有限公司；DPX-9052B-2型電熱恒溫培養箱：上海福瑪實驗設備有限公司；SHP-250A型生化培養箱：上海培因實驗儀器有限公司；Sigma3-16PK臺式高速冷凍離心機：德國希格瑪離心機公司；HI 1220烘片機、HI 1210展片機、RM2235切片機萊卡：德國徠卡公司；Microlab 300生化儀：合普機電工程（天津）有限公司；TEK-Ⅱ全自動三分群血細胞分析儀：江西特康科技有限公司。

1.3 菌株T-2發酵液的制備及濃縮

挑取在YPD平板上新鮮培養的T-2單菌落，接入到YPD液體培養基中，于28℃、200 r/min下搖培發酵48 h，菌體濃度約為1×1011cfu/mL，于12 000 r/min下冷凍離心2 min，使菌體沉淀，棄上清液，留菌體，加入0.5 mL YPD液體培養基，振蕩混勻后備用；同時，將發酵液分別濃縮為10倍液（50 mg/L）、50倍原液（250 mg/L）、100倍原液（500 mg/L）和 400倍原液（2 000 mg/L），備用。

1.4 急性毒性實驗

參照GB15193.3-2014《食品安全國家標準急性經口毒性試驗》[11]，實驗按照限量法[11]，取 20 只 180 g～220 g的清潔級昆明大鼠（n=10），雌雄各半，適應性飼養2 d～3 d。隨機分組標號，禁食16 h后，設T-2菌體為10 g/kg劑量，按大鼠最大耐受容積（1 mL/只）對大鼠進行灌胃處理，以生理鹽水為對照組，連續2次灌胃，間隔4h，觀察14d，記錄小鼠中毒癥狀和死亡時間[12-13]。

1.5 遺傳毒性實驗

1.5.1 Ames實驗

選取經鑒定符合實驗要求的4株鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102進行實驗。以大鼠肝S-9混合液作為代謝活化系統，按AMES試劑盒說明書進行操作，受試物為滅活的酵母菌，實驗分別設4個劑量組，各劑量組酵母菌濃度分別為 5×1010、1×1010、2×109、4×108CFU/皿，相當于 5、1、0.2、0.04 mg/皿。采用平板摻入法，每個菌株每個測試劑量均做3個平行皿，37℃下培養48 h后計數每皿回變菌落數。

1.5.2 精子畸變實驗

取25只清潔級昆明成年雄鼠（n=5），適應性飼養2 d～3 d。隨機分組標號，用T-2菌株的100倍原液（500 mg/L）、10倍原液（50 mg/L）、原液（5 mg/L）對小鼠進行灌胃處理（0.1 mL/只），陽性對照組灌胃環磷酰胺40 mg/（kgbw·d），陰性對照組為生理鹽水組，連續5 d灌胃，末次灌胃后的第30天斷頸處死；取其雙側附睪，撕開包膜，用吸管反復吸打多次，懸液制片，伊紅染色。每只小鼠觀察1 000個完整精子，記錄各類畸形精子數，計算精子畸變率（%）[14]。

1.5.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗

取50只18g～20g的清潔級昆明小鼠（n=10），雌雄各半，適應性飼養2 d～3 d。隨機分組標號，用T-2菌株的100倍原液（500mg/L）、1/4的100倍原液（125mg/L）、1/16的100倍原液（31.25 mg/L）對小鼠進行灌胃處理（0.1mL/只），陽性對照組灌胃環磷酰胺40mg/（kgbw·d），陰性對照組為生理鹽水組，連續2次灌胃，間隔24 h，末次灌胃6 h～12 h后，小鼠斷頸處死，取股骨骨髓溶于小牛血清，涂片后甲醇固定，染色制片，油鏡觀察1000個嗜多染紅細胞（polychromaticerythrocytes，PCE）及PCE微核發生率[15]。

1.6 30天經口毒性實驗

取56只18 g～20 g的清潔級昆明小鼠（n=14），雌雄各半，適應性飼養2 d～3 d。隨機分組標號，用酵母菌的 100倍原液（500 mg/L）、50倍原液（250 mg/L）、10倍原液（50 mg/L）對小鼠進行灌胃處理（0.1 mL/只），對照組灌胃等體積的生理鹽水組，連續30 d灌胃，觀察小鼠的活動和生長情況，每日記錄其飲水量、攝食量，每2 d稱體重1次，計算其食物利用率。30 d后眼球取血，測血液學和血液生化指標，處死后摘除指定內臟測其臟器指數，將各臟器用10%中性甲醛溶液固定，進行常規病理取材、制片和HE染色（蘇木精-伊紅染色法，hematoxylin-eosinstaining），顯微鏡下進行病理組織學檢查[16]。

1.7 數據處理

統計方法采用SPSS統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（Mean±SD）表示，以P＜0.05和P＜0.01為差異，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 急性毒性實驗

在觀察期間內，灌胃T-2菌株的大鼠均未出現不良反應，72 h內各處理組未出現死亡現象，且各處理組的進食、飲水以及各種生命活動與對照相比均無明顯異常；經連續飼養觀察14 d，所有實驗鼠生命表現依然正常。未見驚厥、被毛粗亂、行動異常等異常表現，生長情況良好，無死亡發生。結果表明，菌株T-2對大鼠的急性經口半致死劑量（LD50）＞10 g/kg。表明T-2菌株的急性經口毒性為“無毒”級[11]。

2.2 遺傳毒性實驗

2.2.1 Ames實驗

實驗結果如表1所示。

加與不加S9的代謝活化系統，其自發回變組、溶劑對照組、陽性對照組均在正常范圍，受試樣品各劑量組回變菌落數均未見明顯增加，未超過自發回變菌落數的2倍及以上，亦無劑量-反應關系（重復試驗結果具有很好的重現性）。實驗結果表明，在本實驗條件下，該酵母菌在Ames實驗中無致突變性。

表1 Ames實驗結果（±s，n=3）Table 1 The results in Ames test（±s，n=3）

表1 Ames實驗結果（±s，n=3）Table 1 The results in Ames test（±s，n=3）

注：**P＜0.01，與溶劑對照組比較有極顯著差異。

組別/（mg/皿）TA97 TA98 TA100 TA102-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 5 231.0±19.5 196.6±20.9 87.7±9.0 61.2±7.5 163.3±16.9 236.1±17.7 210.3±18.9 231.3±20.9 1 128.8±13.3 102.5±10.9 37.0±4.7 35.7±5.9 91.2±11.0 86.5±9.3 215.7±16.7 206.1±21.7 0.2 146.4±12.8 74.3±11.8 79.3±8.8 52.3±6.0 52.7±6.7 65.2±9.1 208.3±21.3 232.6±19.0 0.04 67.1±7.5 83.0±10.4 44.1±6.3 31.3±5.0 24.0±4.9 39.2±5.5 196.4±22.2 181.2±18.4自發 111.3±15.5 89.5±11.6 34.2±5.3 26.4±6.8 112.2±11.9 190.1±19.7 188.6±19.1 243.2±20.6溶劑 122.5±21.6 107.1±22.3 32.7±7.9 43.1±6.1 99.1±10.1 138.0±12.3 116.1±19.9 116.5±23.0陽性 2 612.0±322.8**1 964.1±363.1**2 557.4±119.9**1 822.0±212.2**1 583.6±259.2**1 187.2±199.1**1 757.9±240.9**1 831.3±319.8**

2.2.2 精子畸變實驗

酵母菌株T-2對小鼠精子畸形率的影響如表2所示。

陽性對照組（環磷酰胺）小鼠精子畸形率為0.15%，畸變發生率極顯著高于灌胃酵母菌的各劑量組及陰性對照組（生理鹽水）（P＜0.01），而酵母菌T-2各劑量組小鼠精子畸形率未出現明顯增加，與陰性對照組（生理鹽水）比較，無顯著性差異（P＞0.05）。說明在實驗劑量范圍內，菌株T-2對小鼠精子無致畸作用。

表2 小鼠精子畸形實驗結果（±s，n=3）Table 2 Effect of T-2 on sperm abnormality rate in mice（±s，n=3）

表2 小鼠精子畸形實驗結果（±s，n=3）Table 2 Effect of T-2 on sperm abnormality rate in mice（±s，n=3）

注：**P＜0.01，與生理鹽水（陰性）對照組比較有極顯著差異。

組別 動物數 觀察精子數 畸形精子數 畸形率/%環磷酰胺 5 5×1 000 742 0.15**生理鹽水 5 5×1 000 137 0.03 500 mg/L 5 5×1 000 157 0.03 50 mg/L 5 5×1 000 144 0.03 5 mg/L 5 5×1 000 140 0.03

2.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗

菌株T-2對小鼠骨髓PCE微核實驗的影響如表3所示。

表3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果（±s，n=3）Table 3 Effect of T-2 on microkernel rate of polychromatic erythrocytes in mice（±s，n=3）

表3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果（±s，n=3）Table 3 Effect of T-2 on microkernel rate of polychromatic erythrocytes in mice（±s，n=3）

注：**P＜0.01，與生理鹽水（陰性）對照組比較有極顯著差異。

組別 動物數 PCE個數 微核數 微核率/%雌鼠生理鹽水組 5 5×1 000 4 1.0±0.7雌 500 mg/L 5 5×1 000 7 1.4±0.5雌 125 mg/L 5 5×1 000 7 1.4±0.9雌 31.25 mg/L 5 5×1 000 7 1.4±0.5雌環磷酰胺組 5 5×1 000 63 12.6±2.1**雄鼠生理鹽水組 5 5×1 000 5 1.0±0.7雄 500 mg/L 5 5×1 000 8 1.6±0.5雄 125 mg/L 5 5×1 000 7 1.4±0.5雄 31.25 mg/L 5 5×1 000 6 1.2±0.4雄環磷酰胺組 5 5×1 000 89 17.8±2.4**

與小鼠精子畸形實驗結果相似，環磷酰胺組即陽性對照組小鼠骨髓細胞的微核率極顯著高于生理鹽水組即陰性對照組微核率和菌株T-2各劑量組微核率（P＜0.01）。各酵母菌劑量組小鼠骨髓細胞的微核率與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。說明在實驗劑量范圍內，菌株T-2不會對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核造成顯著影響，即菌株T-2的小鼠骨髓嗜微核實驗結果為陰性。

2.3 小鼠30天經口毒性實驗

小鼠生產性能實驗結果見表4，小鼠血常規實驗結果見表5，小鼠血生化實驗結果見表6。

由表4可知，灌胃菌株T-2的高（500 mg/L）、中（250 mg/L）、低（50 mg/L）各劑量組雌鼠和雄鼠的生產性能（即體質量與攝食量）數據雖都有所增加，但變化幅度較小，未見明顯的劑量依賴關系，且與對照組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。說明菌株T-2對小鼠的生產性能（即體質量與攝食量）無明顯影響。由表5、表6可知，灌胃菌株T-2高、中、低各劑量組小鼠的血常規指標和血液生化指標與對照組均無顯著差異（P＞0.05）。說明菌株T-2對小鼠的血液常規指標沒有影響。灌胃菌株T-2各實驗組小鼠心、肝、脾、肺、腎臟器指數與對照組均無顯著差異（P＞0.05），結果見表7。說明該菌株對小鼠的臟器指數沒有影響。

表4 小鼠生產性能實驗結果（±s，n=3）Table 4 Effect of T-2 on performance in mice（±s，n=3）

表4 小鼠生產性能實驗結果（±s，n=3）Table 4 Effect of T-2 on performance in mice（±s，n=3）

注：P＞0.05，與對照組比較，各處理組小鼠體重及攝食量指標無顯著性差異。

組別 只數 初重/g 末重/g 增重/g 攝食量/g 料重比雌 對照組 7 21.03±1.02 32.35±3.08 11.32±2.51 122.85 10.86±2.34雌 50 mg/L 7 22.28±1.67 31.51±1.51 9.23±1.08 133.31 14.45±1.73雌 250 mg/L 7 23.69±2.42 33.08±2.88 9.39±1.01 121.05 12.89±1.35雌 500 mg/L 7 22.92±2.11 31.14±0.27 8.23±2.00 115.31 14.02±3.65雄 對照組 7 24.97±0.65 38.58±2.62 13.61±2.41 139.83 10.28±1.84雄 50 mg/L 7 25.16±0.67 38.19±2.34 13.03±2.66 138.58 10.64±2.99雄 250 mg/L 7 24.55±1.48 36.80±3.66 12.26±2.87 125.82 10.27±3.87雄 500 mg/L 7 24.29±1.22 36.87±2.17 12.58±1.18 134.59 10.70±1.02

表5 小鼠血常規實驗結果（±s，n=3）Table 5 Effect of T-2 on blood routine index in mice（±s，n=3）

表5 小鼠血常規實驗結果（±s，n=3）Table 5 Effect of T-2 on blood routine index in mice（±s，n=3）

注：P＞0.05，與對照組比較，各處理組小鼠血常規指標無顯著性差異。

組別紅細胞/（1012/L）白細胞/（109/L）血紅蛋白/（g/L）血小板/（109/L）中性細胞數/（109/L）對照組 10.74±1.02 2.44±0.63 158.50±22.01 588.00±534.73 0.65±0.26 50 mg/L 10.23±0.39 4.15±2.53 161.86±5.08 505.14±193.40 0.83±0.31 250 mg/L 10.76±0.56 3.85±1.20 164.17±6.18 777.70±405.48 0.96±0.29 500 mg/L 10.21±0.61 2.71±0.47 162.60±7.23 684.64±450.07 0.54±0.13組別淋巴細胞數/（109/L）單核細胞/（109/L）中性細胞比率/%淋巴細胞比率/%單核細胞比率/%對照組 1.59±0.54 0.08±0.05 27.10±10.05 64.13±13.11 2.90±1.57 50 mg/L 2.91±1.92 0.15±0.13 20.77±7.98 68.05±4.83 3.13±1.59 250 mg/L 2.58±0.95 0.04±0.02 29.73±9.90 65.93±8.10 1.13±0.39 500 mg/L 1.78±0.45 0.07±0.03 19.80±2.53 65.00±6.83 2.68±1.44

表6 小鼠血生化實驗結果（±s，n=3）Table 6 Effect of T-2 on blood biochemistry indexes in mice（±s，n=3）

表6 小鼠血生化實驗結果（±s，n=3）Table 6 Effect of T-2 on blood biochemistry indexes in mice（±s，n=3）

注：P＞0.05，與對照組比較，各處理組小鼠血清生化指標無顯著性差異。

白蛋白/（g/L）對照組 61.52±9.22 124.73±41.00 2.51±1.26 34.11±0.87 50 mg/L 70.61±9.67 168.03±58.50 2.09±0.18 34.23±1.01 250 mg/L 72.44±11.89 180.85±50.21 2.31±0.56 37.77±5.48 500 mg/L 74.38±13.16 153.43±38.32 2.11±0.15 35.12±3.60組別 谷丙轉氨酶/（U/L）谷草轉氨酶/（U/L）甘油三酯/（mmol/L）總蛋白/（g/L）58.64±1.32 58.60±2.11 59.69±4.69 57.70±1.57總膽固醇/（mmol/L）血糖/（mmol/L）4.46±0.90 20.83±3.53 47.41±18.00 6.00±1.79 3.78±0.89 19.16±2.67 37.02±19.14 6.30±1.23 4.43±0.48 18.83±4.07 29.61±22.00 7.12±2.49 3.85±0.59 18.62±3.80 36.52±10.52 7.00±1.54血尿素氮/（mg/dL）肌酐/（μmol/L）

菌株T-2對小鼠臟器病理組織學的影響見圖1，實驗期間各組大鼠各器官剖檢均未見明顯病理變化， 即對臟器組織沒有損傷。

表7 臟器指數實驗結果（±s，n=3）Table 7 Effect of T-2 on organ index in mice（±s，n=3）

表7 臟器指數實驗結果（±s，n=3）Table 7 Effect of T-2 on organ index in mice（±s，n=3）

注：P＞0.05，與對照組比較，各處理組小鼠臟器指數無顯著性差異。

組別 只數 心/% 肝/% 脾/% 肺/% 腎/%對照組 8 0.57±0.07 3.83±0.53 0.28±0.04 0.61±0.14 1.03±0.25 50 mg/L 8 0.50±0.06 3.78±0.34 0.31±0.06 0.65±0.15 1.01±0.23 250 mg/L 8 0.56±0.10 3.77±0.46 0.30±0.06 0.64±0.09 1.07±0.24 500 mg/L 8 0.56±0.12 3.89±0.46 0.23±0.07 0.52±0.08 0.93±0.14

圖1 菌株T-2對小鼠臟器病理組織學的影響（HE×400）Fig.1 Effect of T-2 on visceral organ changes in rats（HE×400）

3 結論

許多研究表明酵母菌是一種理想的生防制劑[17]，因為它具有能夠附生在植物上面，對植物和人類沒有致病性且能迅速增殖、遺傳穩定、有較強抗逆性等優點，更容易被人們所廣泛接受[18]。而美極梅奇酵母菌T-2作為一株具有采后生防潛力的酵母菌株，將其制成生防制劑，保證菌體本身及其所產活性代謝產物對動物的安全性是最基本的要求之一[19]。本研究采用清潔級鼠，用美極梅奇酵母菌T-2對小鼠進行灌胃處理，參照GB 15193.1-2014[9]進行了致突變性評價，可進一步探明生防菌對動物體正常生理代謝的影響[20]，為酵母菌作為采后保鮮生防制劑的食用安全性提供一定的科學依據。

實驗結果表明，菌株T-2對大鼠的急性經口毒性屬于“無毒”級（LD50＞10 g/kg）[11]。酵母菌 T-2 在 Ames實驗中未呈現致突變性。在小鼠精子畸形實驗中，50 mg/L～500 mg/L實驗劑量范圍內，小鼠各劑量組與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）；骨髓細胞微核實驗是一種用于檢測細胞內染色體損傷的化學毒物的實驗方法[21]，在31.25 mg/L～500 mg/L的實驗劑量范圍內，小鼠骨髓微核實驗結果為陰性。血液學指標反映機體內環境及造血功能的變化，血清生化指標檢驗機體生理成分、代謝情況及重要器官的功能狀態，其中腎功能及肝功能的變化是考察藥物是否存在蓄積毒性。本實驗結果顯示酵母菌T-2在50、250、500 mg/L各劑量組血液學與血清生化結果均在正常參考值范圍內，與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。病理組織學檢查也未見明顯肝臟功能性損傷，臟器指數也無顯著性差異，說明酵母菌T-2不會對小鼠臟器造成損害。

綜上所述，可以推斷出在嚴格控制使用劑量和使用方法的情況下，美極梅奇酵母T-2對人體不會產生不良遺傳毒性影響。因此在商業化貯藏保鮮果品中使用該生防菌劑防治病害是比較安全的，具有進一步研究開發的價值。