骨修復用串晶結構PCL/β-TCP復合纖維膜的制備及性能

張天添，劉來俊，蔣冠森，李凌晨，李超婧，王 璐，王富軍

(1. 東華大學 a. 紡織學院；b. 紡織面料技術教育部重點實驗室，上海 201620；2. 杭州銳健馬斯汀醫療器材有限公司，浙江 杭州 311199)

隨著社會的快速發展，由骨組織炎癥、骨腫瘤、意外事故、人口老齡化等原因造成的骨組織缺損的病例日趨增多[1]。傳統骨缺損的修復手段主要包括自體骨移植和異體骨移植，但因存在來源有限、損傷供體部位(自體骨移植)及免疫排斥(異體骨移植)等缺點，限制了其在骨修復領域中的應用[2-4]。采用人工材料修復骨缺損的方法能夠很好地彌補傳統修復手段所存在的問題，同時可以通過材料設計賦予人工修復材料更優異的生物相容性、生物降解性和骨誘導性[5]。纖維型骨修復材料能夠模擬天然骨的成分及結構特性，為骨類細胞的黏附和生長提供一個良好的平臺[6-8]。在眾多的纖維成型手段中，靜電紡絲法不僅方法穩定而且技術通用，在骨修復領域中得到廣泛應用[9-10]。

研究表明，材料表面微納米尺度的拓撲結構會影響細胞的黏附、增殖、分化等行為[11-13]。因此，在靜電紡纖維表面引入適當的微納米結構，可對調控骨類細胞的行為起到積極作用。目前主要通過調節紡絲參數或是結合后處理工藝制備不同表面結構的纖維。串晶(shish-kebab，SK)結構是半晶聚合物中的一種特殊的界面結晶結構，由伸直鏈晶體及折疊鏈晶體(片晶)兩部分組成。電紡纖維膜可作為伸直鏈晶體，在一定溫度下誘導聚合物垂直于其表面周期性生長從而形成片晶[14]。SK結構纖維膜因具有較大的比表面積及粗糙的表面，能影響細胞行為，包括細胞增殖和堿性磷酸酶活性，有利于成骨細胞沉積骨基質并以有效的方式再生骨組織[15]。

聚己內酯(PCL)與β-磷酸三鈣(β-TCP)是目前比較常用并且性能優異的骨修復材料。大量文獻研究指出，將這兩種材料復合起來可以起到取長補短的效果，制備出的骨修復材料更有利于骨類細胞的黏附、增殖，并且修復缺損組織的效果明顯[16]。本文結合靜電紡絲和溶液誘導結晶法，通過改變形成片晶的PCL溶液的質量分數，制備具有不同片晶尺寸的骨修復用SK結構的PCL/β-TCP復合纖維膜。對SK結構復合纖維膜的形貌、物理性能等進行表征，并分析不同片晶尺寸的SK結構PCL/β-TCP復合纖維膜的體外礦化性及對細胞增殖行為的影響，旨在制備出更具有應用前景的骨修復材料。

1 試 驗

1.1 試驗材料

PCL，相對分子質量為80 000，Sigma試劑有限公司；β-TCP，類球形，直徑<200 nm，百靈威科技有限公司；二氯甲烷(DCM)、N-N二甲基甲酰胺(DMF)、冰醋酸，上海凌峰化學試劑有限公司；氯化鈉(NaCl)、碳酸氫鈉(NaHCO3)、氯化鉀(KCl)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、六水氯化鎂(MgCl2·6H2O)、氯化鈣(CaCl2)、硫酸鈉(Na2SO4)、三羥甲基氨基甲烷((CH2OH)3CNH2)，國藥集團化學試劑有限公司；rBMSCs(大鼠骨髓間充質干細胞)、rBMSCs完全培養基(大鼠骨髓間充質干細胞完全培養基)，中國科學院上海細胞庫；細胞計數試劑盒8(CCK-8試劑盒)，上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 串晶結構PCL/β-TCP復合纖維膜的制備

將一定質量的PCL溶于DCM和DMF的混合溶劑中(V(DCM)∶V(DMF)=3∶1)，配制質量分數為15%的溶液，再稱取一定質量的β-TCP加入到溶液中，使β-TCP占PCL質量的10%，超聲處理1 h后，磁力攪拌12 h以形成均一穩定的紡絲液。靜電紡絲選用規格為19 G的針頭，電壓為15 kV，紡絲推注速度為1.2 mL/h，接收距離為15 cm，環境參數為溫度保持22～25 ℃、相對濕度保持30%～40%。紡絲完成后將纖維膜在37 ℃下真空干燥24 h以去除殘留的溶劑。將該纖維膜記為PT10復合纖維膜。在PT10復合纖維膜的基礎上采用溶液誘導結晶法獲得SK結構復合纖維膜。操作步驟如下：稱取不同質量的PCL加入到質量分數為77%的醋酸水溶液中，使PCL分別占溶液質量的0.1%、0.5%和1.0%，在60 ℃下加熱攪拌5 h至完全溶解，冷卻至室溫后滴加到3 cm×3 cm的PT10復合纖維膜上，在37 ℃下真空干燥48 h。記質量分數分別為0.1%、0.5%和1.0%的PCL溶液所制備出的SK結構PT10復合纖維膜為PT10-SK0.1、PT10-SK0.5和PT10-SK1.0復合纖維膜。

1.3 理化性能測試與表征

微觀形貌：采用日本日立公司的JSM 6490型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察復合纖維膜的微觀形貌，并通過Image J軟件測量纖維表面的幾何尺寸。每種試樣選取100根纖維測量并取平均值。

結晶度：采用日本Rigaku公司的D/Max-2550 PC型X射線衍射儀對復合纖維膜進行X射線衍射(XRD)測試，并計算結晶度。參數設定：輻射波長為1.540 56×10-10m，管電壓為40 kV，管電流為200 mA，掃描速度為1 (°)/min，掃描范圍為2θ=5°～60°。

接觸角：采用德國DATAPHYSICS公司的OCA 20型接觸角測試儀對復合纖維膜進行靜態接觸角測試。檢測用水為超純水和磷酸緩沖鹽(PBS)溶液，體積為5 μL，液滴接觸纖維膜后靜置10 s再測量。每種試樣隨機取5個點測量并取平均值。

比表面積：采用美國康塔儀器公司的Quadra Sorb SI型比表面積分析儀對復合纖維膜進行比表面積測試。使用氮氣吸附法進行測量，根據比表面積公式計算固體材料單分子層的吸附體積，以得到最終比表面積數值[17]。每種試樣測量3次并取平均值。

力學性能：采用中國大榮紡織有限公司的醫用紡織品多功能強力儀，參照ASTM D638—2003《塑料拉伸性能測定方法》對復合纖維膜進行力學性能測試。將纖維膜裁剪成尺寸為20 mm×3 mm的矩形，用臺式測厚儀測量纖維膜的厚度。參數設定：標距長度為10 mm，拉伸速度為10 mm/min，預加張力為0.1 N。每種試樣測量5次并取平均值。

1.4 生物性能評價

1.4.1 體外礦化

配制1.5倍人體模擬體液(SBF)。1 L的1.5倍人體模擬體液(1.5×SBF)配方如表1所示，用1.0 mol/L HCl調節溶液pH值至7.4[18]。

表1 1.5×SBF配方

將纖維膜裁剪成尺寸為2.0 cm×2.5 cm的試樣，浸泡在裝有50 mL的1.5×SBF離心管內7 d，溫度恒定為37 ℃，每3 d換液。到達預定時間點后將試樣取出，用去離子水清洗干凈，在37 ℃下真空干燥48 h。

1.4.2 細胞增殖

(1) 材料準備：將纖維膜裁剪成直徑為14 mm的圓形試樣，每種試樣準備3個平行樣放置于24孔板內。酒精熏蒸24 h，加入滅菌好的不銹鋼環固定試樣，繼續熏蒸24 h后將試樣轉移至超凈工作臺，用無菌PBS溶液清洗3次。

(2) 細胞種植：本試驗選用第4代rBMSCs。細胞養殖至所需數量后，先用預熱的無菌PBS溶液清洗細胞，后加入適量胰酶消化，2 min后加入rBMSCs完全培養基以終止消化，將細胞轉移至離心管后以1 200 r/min轉速離心，5 min后棄去上清液，加入1 mL rBMSCs完全培養基進行細胞計數，細胞種植密度為2×104個/孔。種植完成后置于細胞培養箱中分別培養1、4、7 d，隔天換液。

(3) 細胞增殖定量測試：采用CCK-8法檢測細胞增殖。到達預定時間后，吸取孔板內的完全培養基，并用無菌PBS溶液清洗3次以去除未貼壁的游離細胞，然后每孔加入500 μL的含10% CCK-8工作液的培養基，放入培養箱中培養3 h后轉移至96孔板，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值。

1.5 統計學分析

本文數據均以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析比較組內與組間的顯著性差異。P<0.05時，若認為組內差異顯著，用*表示，若認為組間差異顯著，用#表示；P<0.01時，認為組內差異非常顯著，用**表示。

2 結果與討論

2.1 形貌分析

微納米纖維表面形貌、粗糙度等對細胞的黏附及生長形態有顯著影響，是調節細胞行為的重要參數[19]。本研究對不同片晶尺寸的SK結構復合纖維膜進行SEM觀察，并進行纖維表面幾何形貌分析，結果如圖1所示。由圖1(a)可知，PT10復合纖維表面平滑，平均直徑約為1.150 μm。由圖1(b)可知，PT10-SK0.1復合纖維膜中晶體大部分以點狀形式分布在纖維的表面，且沒有明顯的周期性，因此后期將不再進行探究。由圖1(c)～1(e)可知，在PT10-SK0.5和PT10-SK1.0復合纖維膜中，可以明顯看到纖維表面片晶的存在，并且其垂直于纖維軸向呈周期性排列，片晶大小(參數意義見圖1(e))由153 nm增加到338 nm，周期性距離由385 nm增加到503 nm。此外，PT10-SK0.5和PT10-SK1.0復合纖維膜中直徑較小的纖維，片晶排列規整度高，而直徑較大的纖維，片晶規整度較弱，出現塌陷、扭曲以及結構重排現象。這是因為靜電紡制得的微納米纖維直徑具有一定的不均勻性，直徑較小的纖維，由于受到的牽伸力大，PCL分子間重排，從而形成具有較高規整度的片晶，而直徑較大的纖維，PCL分子間纏結作用強，鏈段運動受阻，導致片晶規整度較弱。通過改變PCL溶液的質量分數，制備了不同片晶尺寸的SK結構復合纖維膜，片晶給予纖維膜更粗糙的表面，對骨類細胞的生長及增殖具有一定的影響。

(a) PT10

(b) PT10-SK0.1

(c) PT10-SK0.5

(d) PT10-SK1.0

(e) 串晶結構復合纖維的示意圖及表面幾何形貌信息圖

圖1 不同片晶尺寸的串晶結構復合纖維膜SEM圖及表面幾何形貌信息圖

2.2 結晶度分析

對不同片晶尺寸的SK結構復合纖維膜進行XRD測試，結果如圖2所示。由圖2可知，在2θ為21.2°處出現了明顯的衍射峰，該峰為PCL的特征峰，3種纖維膜特征峰的峰強相差較大。通過分峰處理計算得到的3種纖維膜的結晶度如表2所示。由表2可知，PT10-SK0.5和PT10-SK1.0復合纖維膜的結晶度明顯高于PT10復合纖維膜。這是因為在誘導結晶過程中，形成了高度延伸的PCL大分子鏈，PCL片晶沿著纖維軸向周期性排列，賦予纖維一定的取向型，其中PT10-SK1.0復合纖維膜具有更大尺寸的片晶，因此纖維膜的結晶度更大。

圖2 不同片晶尺寸的串晶結構復合纖維膜XRD圖Fig.2 XRD image of shish-kebab structured composite fiber membranes with different kebab sizes

2.3 接觸角分析

接觸角是表征纖維膜親疏水性的常用方法，接觸角越大，表明材料越疏水，而材料的親疏水性影響著細胞的黏附、遷移、分化等生物學行為[20]。Dalton等[21]選用成骨細胞作為試驗細胞，采用磺酸處理聚苯乙稀表面，證明材料表面親水性的改善促進了成骨細胞的黏附和遷移。為了評價纖維表面結構對材料親疏水性的影響，對不同片晶尺寸的SK結構復合纖維膜分別進行超純水接觸角及PBS溶液接觸角測試，結果如圖3所示。

表2 不同片晶尺寸的串晶結構復合纖維膜的結晶度

圖3 不同片晶尺寸的串晶結構復合纖維膜的接觸角Fig.3 Contact angle of shish-kebab structured composite fiber membranes with different kebab sizes

由圖3可知，3種復合纖維膜均為疏水纖維膜。這是因為PCL是疏水材料，而β-TCP主要包覆在纖維內部，無法發揮其親水性。PT10復合纖維膜的超純水接觸角約為135.1°，呈現較高的疏水性。PT10-SK0.5和PT10-SK1.0復合纖維膜的超純水接觸角均顯著小于PT10復合纖維膜(P<0.01)，并且PT10-SK1.0復合纖維膜超純水接觸角小于PT10-SK0.5復合纖維膜(P<0.05)。這可能是因為片晶會占據一定的空間，迫使纖維間的距離變大，從而導致纖維間孔徑增加，使得水更容易滲入，而PT10-SK1.0復合纖維膜因具有更大尺寸的片晶，所以接觸角下降更為顯著。PBS溶液接觸角和超純水接觸角變化規律一致，但PBS溶液接觸角比超純水接觸角略微減小(P<0.05)。這是因為PBS溶液中含有鈉、氯、鉀等親水性離子，當液滴滴加到纖維膜表面時，由于吸附上一些親水性離子，使得纖維膜的接觸角減小，但是材料固有的高疏水性使得接觸角未發生明顯變化。以上結果表明，片晶的存在可以增加纖維膜的親水性，擁有大片晶的纖維膜的親水性改善更為顯著，這對骨類細胞的增殖、分化具有積極作用。

2.4 比表面積分析

研究表明，材料的比表面積越大，則特異性結合位點越多，更有助于細胞的增殖和分化[22]。本研究對不同片晶尺寸的SK結構復合纖維膜進行氮氣吸附-脫附試驗，以求得纖維膜的比表面積，結果如圖4所示。

圖4 不同片晶尺寸的串晶結構復合纖維膜的吸附-脫附曲線Fig.4 Adsorption-desorption isotherms of shish-kebab structured composite fiber membranes with different kebab sizes

由圖4可知，3種復合纖維膜的吸附-脫附曲線接近于遲滯回線型曲線[23]。當相對壓力(p/p0)為0.3～0.8時，吸附量上升緩慢，為單分子層向多分子層過渡階段，屬于多孔表面的多層吸附；當p/p0為0.9～1.0時，吸附量急劇上升，為多分子層吸附過程，歸因于大孔的毛細凝聚作用[24]。圖4曲線顯示了3種復合纖維膜中介孔和大孔兩種尺寸孔的共存[25]。PT10、PT10-SK0.5和PT10-SK1.0復合纖維膜的比表面積分別為4.27、4.63和5.28 m2/g，因此說明PCL納米片晶的形成增加了復合纖維膜的比表面積，可為細胞提供更大的生長空間。

2.5 力學性能分析

骨修復材料優良的力學性能可滿足骨類細胞生長要求，能夠提供骨組織形成所需的空間，對于纖維型骨修復材料，其主要依靠纖維結構及材料本身的力學性能[26]。本研究對不同片晶尺寸的SK結構復合纖維膜進行力學性能測試，結果如圖5所示。

(a) 拉伸曲線

(b) 斷裂強度和斷裂伸長率

由圖5(a)可知，在拉伸過程中，纖維膜所受的拉伸強度達到峰值后隨著伸長率的增加而減小。這是因為纖維排列無序、堆疊纏結，在拉伸過程中存在纖維滑移等現象，因此纖維膜的斷裂無法瞬間完成。由圖5(b)可知，3種復合纖維膜的斷裂伸長率都大于200%。這是因為PCL是一種韌性材料，賦予纖維膜優異的延展性。與PT10復合纖維膜相比，PT10-SK0.5和PT10-SK1.0復合纖維膜具有更加優異的力學性能，其中，PT10-SK1.0復合纖維膜的斷裂強度和斷裂伸長率分別達到2.98 MPa和281.34%。這種力學性能的改善可能是因為當纖維間的距離小于片晶尺寸時，片晶會在纖維之間形成“結點”，而這種“結點”的存在有利于外力的傳遞，從而賦予纖維膜更優異的力學性能[27]。

2.6 體外礦化分析

礦化是骨修復性能的重要評價指標之一。研究表明，當具有生物活性的骨修復材料植入體內后，材料表面會形成磷灰石進而自發與周圍骨組織結合，其中磷灰石的含量及分布受到材料表面結構的影響[28]。目前，在體內測試材料的礦化性能較為困難，因此大多數研究人員通常采用模擬體液的方法測試材料的體外礦化能力，從而評價材料的生物活性[29]。本研究對不同片晶尺寸的SK結構復合纖維膜的礦化結果進行SEM觀察，結果如圖6所示。由圖6可知，3種復合纖維膜置于1.5×SBF 7 d后，在纖維表面能觀察到不同數量的磷灰石的沉積。PT10復合纖維膜中磷灰石呈菜花狀分布在纖維表面，但含量較少且分布不均勻。PT10-SK0.5復合纖維膜中磷灰石含量增加，并且磷灰石沿著纖維方向呈現較為均勻的生長。這可能是因為片晶的存在使得纖維間的間距變大，從而有利于SBF溶液的滲入。隨著片晶尺寸的繼續增大，PT10-SK1.0復合纖維膜誘導更多的磷灰石均勻沉積在纖維表面，并且纖維中的片晶結構已經被磷灰石完全覆蓋。體外礦化結果可以表明，片晶的存在可加速磷灰石的沉積，并有利于磷灰石的均勻分布，賦予復合纖維膜更加優異的生物活性。

(a) PT10

(b) PT10-SK0.5

(c) PT10-SK1.0

2.7 細胞增殖分析

纖維表面結構對細胞的形態、增殖、分化等具有調節作用，進而影響組織的再生重塑[19]。本研究采用CCK-8法對不同片晶尺寸的SK結構復合纖維膜進行細胞增殖試驗，結果如圖7所示。

圖7 不同片晶尺寸的串晶結構復合纖維膜的細胞增殖Fig.7 Cell proliferation of shish-kebab structured composite fiber membranes with different kebab sizes

由圖7可知，3種復合纖維膜的吸光度值都隨培養時間的延長而增加。培養1 d后，PT10-SK0.5和PT10-SK1.0的吸光度值均顯著高于PT10復合纖維膜(P<0.01)，且PT10-SK1.0吸光度值高于PT10-SK0.5復合纖維膜(P<0.05)。這是因為PT10-SK1.0復合纖維膜具有較大的比表面積，為細胞提供了更多的黏附位點，從而促進了細胞的黏附與增殖。此外，PT10-SK1.0復合纖維膜展現出較好的親水性，這也有利于細胞的黏附與增殖。培養4、7 d后，PT10-SK0.5和PT10-SK1.0的吸光度值依舊均顯著高于PT10復合纖維膜(P<0.01)，PT10-SK1.0的吸光度值顯著高于PT10-SK0.5(P<0.01)。細胞增殖結果表明，片晶的存在對細胞的增殖有積極作用，片晶尺寸越大，細胞增殖越顯著。結合體外礦化試驗可以看出，具有大片晶的SK結構復合纖維膜具有更加優異的生物活性與生物相容性，可加速缺損處骨組織的再生。

3 結 語

本文結合靜電紡絲和溶液誘導結晶法，通過改變PCL溶液的質量分數，成功制備了PT10、PT10-SK0.5(片晶大小約為153 nm)及PT10-SK1.0(片晶大小約為338 nm)復合纖維膜，并對以上3種具有不同片晶尺寸的復合纖維膜進行性能測試。結果表明，相比PT10復合纖維膜，PT10-SK1.0的比表面積從4.27 m2/g增加至5.28 m2/g，拉伸斷裂強度從1.61 MPa升高至2.98 MPa，水接觸角從135.1°減小至110.0°。此外，體外礦化結果表明了PT10-SK1.0復合纖維膜更有利于磷灰石的沉積以及均勻分布。細胞增殖7 d的吸光度值從0.41增加至1.01，表明PT10-SK1.0復合纖維膜更有利于rBMSCs的增殖。綜上所述，結合靜電紡絲和溶液誘導結晶法制備的SK結構復合纖維膜具有優異的生物活性及生物相容性，在骨缺損修復領域具有潛在的應用價值。

本文未討論質量分數大于1.0%的PCL溶液制備SK結構復合纖維膜的可行性，需要后續做進一步的研究。