枸杞芽葉有效成分對急性酒精性肝損傷保護作用研究

欒 倩，樊 毅，張 淼，張元強，許露露，哈成勇*，張玉彬*

1 中國藥科大學生命科學與技術學院，南京 211198；2 銀川中科元昊科技有限公司，銀川 750000；3 江蘇省人民醫院浦口分院，南京 211800

我國是肝病大國，隨著新生兒乙肝疫苗的廣泛使用，病毒性肝病正在逐年減少，但隨著人們生活方式的改變，非病毒性肝病正在逐年增加。非病毒性肝病主要包括酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝、非酒精性肝病、藥源性肝病、肝硬化和肝癌等[1]，嚴重影響著人類的健康。ALD是非病毒性肝病的主要代表，也是其他肝病的重要誘因，其發病率逐年增加，并趨向于年輕化發展。ALD初期是長期大量飲酒導致的肝臟病變，其發病機制復雜且研究不夠透徹。目前對于ALD的治療缺少有效藥物，迫切需要研發新的治療藥物[2,3]。

《本草綱目》記載“春采枸杞葉，名天精草”。天精草具有養肝明目、補虛益精之功效。枸杞是傳統中藥，具有護肝明目作用。多年來，人們對枸杞果實的研究較多[4]，但對枸杞葉有效成分用于治療ALD的研究報道相對較少。本論文以枸杞芽葉為原料，從中分離純化制備得到枸杞芽葉有效成分(AILBL)，研究發現其有效成分主要含有一組以黃酮類物質主要成分的抗氧化性物質[5]。ALD發病機制復雜，現代病理學研究發現“二次打擊”學說即氧化應激和炎癥性反應，其中氧化應激是ALD發生與發展的關鍵因素[6]，因此，含有抗氧化性活性成分的枸杞葉有效成分是開發臨床治療ALD的天然藥物資源。本研究旨在探索枸杞芽葉有效成分對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用及可能的抗氧化作用機制，為后期開發具有防治酒精性肝損傷的功能性食品添加劑或保健品提供理論基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與細胞

8周齡雄性ICR小鼠，購于揚州大學比較醫學中心(合格證號：NO.201928893，許可證號：SYXK (蘇)2018-0019)，體重20±2 g，于12小時晝夜交替、通風、恒溫(25 ± 2 ℃)、恒濕(50%～60%)的動物房內飼養，自由飲水，飼以標準實驗動物飼料(購于南京市江寧區青龍山動物繁殖場)。所有動物實驗均按江蘇省和中國藥科大學實驗動物管理與操作要求進行。

人肝癌HepG2細胞購于美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)，用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，并加入100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

1.2 藥品與試劑

枸杞芽葉由寧夏杞芽食品科技有限公司提供，并經中國藥科大學生藥學張勉教授鑒定；無水乙醇和石油醚(上海Titanic科技有限公司)；大孔樹脂HP-20(上海摩速科學器材有限公司)；DPPH(上海源葉生物科技有限公司)；ABTS法檢測總抗氧化能力試劑盒、ALT和AST檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；DCFH-DA、DAPI(Sigma)；增強型ECL化學發光檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限)；抗CYP2E1抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記的IgG二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.3 實驗儀器

高速多功能粉碎機(永康市鑫之鴻電器有限公司)；AF-1型電熱恒溫鼓風干燥箱(江蘇東臺電器廠)；磁力攪拌水浴鍋HCJ-4E(常州朗越儀器制造有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(太倉精宏儀器設備有限公司)；R-201旋轉蒸發儀(上海申勝生物技術有限公司)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；分析天平BS 124S(天津市天馬儀器廠)；電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；752 UV/Vis紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；冷凍干燥機(無錫市金利大紙塑制品有限公司)；酶標儀(美國BioRad)；TGL-20M高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗儀器開發公司)；CO2細胞培養箱(賽默飛世爾科技)；生物安全柜(賽默飛世爾科技)；電泳槽(上海天能科技有限公司)；凝膠成像分析系統(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 枸杞芽葉粗提液(crude AILBL)的制備[5]

將枸杞芽葉用高速多功能粉碎機進行粉碎，采用乙醇回流提取，提取條件為：乙醇濃度78%，提取時間2.5 h，提取溫度75 °C、料液比1∶30，過濾得上清液，將液體靜置于4 °C冰箱12 h后，再過濾，將上清液減壓濃縮至無醇味，再將得到的濃縮液用石油醚萃取脫色，最后將水溶相減壓濃縮至無石油醚味，即得枸杞芽葉粗提液(crude AILBL)。

2.2 枸杞芽葉有效成分(AILBL)的制備[5]

將“2.1”中所得的枸杞芽葉粗提液用HP-20大孔樹脂進行純化，純化條件為：上樣濃度為9.056 mg/mL，上樣流速為2.0 mL/min，上樣體積為8 BV，60%乙醇溶液為洗脫液，洗脫流速為3 mL/min，洗脫劑用量為3 BV。將純化得到的得液體減壓濃縮、凍干，即得枸杞芽葉有效成分(AILBL)。

2.3 ABTS法檢測總抗氧化能力

采用ABTS法，以Trolox溶液、蘆丁溶液為參考標準，體外檢測AILBL的抗氧化活性。取一塊96孔板，分別設定空白孔、對照孔、Trolox標準檢測孔、蘆丁標準檢測孔和樣品檢測孔。按照ABTS試劑盒的操作方法，取10 μL不同濃度的Trolox溶液、蘆丁溶液和AILBL樣品溶液于96孔板，以10 μL蒸餾水為空白，最后每孔分別加入20 μL的ABTS應用液和170 μL的ABTS工作液，混勻，室溫反應6 min，用酶標儀于波長405 nm下檢測各孔吸光度值。ABTS+·清除能力的計算公式如下。

ABTS+·清除能力= [1-(OD檢測-OD對照)/

OD空白]×100%

式中OD檢測為不同濃度的Trolox溶液、蘆丁溶液及樣品溶液測定的吸光值；OD對照為蒸餾水代替ABTS工作液加入測得的吸光值；OD空白為水代替樣品溶液測得的吸光值。

2.4 DPPH法檢測AILBL總抗氧化能力

采用DPPH法[7]，以Trolox溶液、蘆丁溶液為參考標準，體外檢測AILBL的抗氧化活性。精密配置1 mM濃度的DPPH溶液作為儲備液，實驗前將DPPH儲備液稀釋10倍至0.1 mM，得到DPPH工作液；取100 μL蒸餾水于空白孔中，取100 μL不同濃度的Trolox溶液和蘆丁溶液于陽性對照孔中，取100 μL不同濃度的AILBL樣品溶液于檢測孔中，最后加入DPPH工作液100 μL，混勻，室溫避光反應20 min，酶標儀測量各孔在波長517 nm處的吸光度值。DPPH·清除能力的計算公式如下。

DPPH·清除能力=[1-(OD檢測-OD對照)/OD空白]

×100%

式中OD檢測為不同濃度的Trolox溶液、蘆丁溶液及樣品溶液測定的吸光值，OD對照為蒸餾水代替DPPH工作液加入測得的吸光值，OD空白為水代替樣品溶液測得的吸光值。

2.5 動物分組、模型建立及給藥

取雄性ICR小鼠48只，體重20±2 g，適應環境3天后，隨機分為6組，每組8只，分別為正常對照組、酒精模型組(6 g/kg，i.g.)、陽性藥對照組水飛薊素(silymarin)(200 mg/kg，i.g.)、AILBL低、中、高劑量組(30、100、300 mg/kg，i.g.)。各給藥組灌胃給藥每天1次，連續1周，給藥體積為15 mL/kg，對照組和模型組灌胃給予相同體積賦形劑。除正常對照組外，其余各組小鼠于末次給藥結束后12 h，給予小鼠灌胃6 g/kg的酒精，間隔12 h灌胃一次，共3次。

2.6 小鼠肝臟H&E染色和血清生化指標測定

末次灌胃酒精6 h后處理小鼠，眼眶取血，靜置30 min，6 000 rpm離心10 min，常規分離血清。脫頸椎處死小鼠，迅速取出肝組織稱重，并在左肝葉同一部位，同時取小塊肝組織以10%福爾馬林溶液固定，送至武漢塞維爾生物有限公司做常規石蠟包埋、切片以及H&E染色，觀察肝組織病理改變。定量稱取肝組織置于0.9%生理鹽水中勻漿，制備10%肝臟勻漿液，離心后收集上清。按試劑盒說明書要求，用酶標儀法分別測定血清中ALT、AST、肝組織中MDA和GSH含量。

2.7 免疫組化檢測氧化應激相關蛋白

將制備完成的切片按照脫蠟、抗原修復、阻斷內源性過氧化氫酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、脫水、封片的標準步驟進行免疫組化染色，通過軟件分析陽性反應物相對含量，檢測氧化應急相關蛋白CYP2E1、HIF-1α、iNOS的變化。

2.8 體外ROS測定

取對數生長期的HepG2細胞2×105個/孔接種于6孔板中。次日，待細胞融合度達到70%時，給藥組用2 mL含不同濃度AILBL(0、20、40 μg/mL)的培養基預孵育6 h，空白對照組和乙醇模型組加入含等體積的空白溶劑的培養基，然后模型組和給藥組加入46.7 μL無菌乙醇(終濃度400 mM)，空白組加入等體積的無菌水，處理24 h。棄上清，PBS洗三次，加入DCFH-DA探針工作液，37 ℃避光溫育30 min后，PBS再洗兩次。加入DAPI探針工作液，37 ℃避光溫育15 min后，PBS洗三次后，10%多聚甲醛避光固定10 min，熒光顯微鏡下觀察情況，并拍照。

2.9 Westerm blot檢測CYP2E1表達

取對數生長期的HepG2細胞2×105個/孔接種于6孔板中。次日，待細胞融合度達到70%時，給藥組用2 mL含不同濃度AILBL(0、20、40 μg/mL)的培養基預孵育6 h，空白對照組和乙醇模型組加入含等體積的空白溶劑的培養基，然后模型組和給藥組加入46.7 μL無菌乙醇(終濃度400 mM)，空白組加入等體積的無菌水，處理24 h。收集細胞，用冰冷的RIPA裂解液進行細胞裂解，超聲裂解后于4 ℃、12 000 g下離心20 min，吸取上清以BCA法測定蛋白濃度。蛋白上樣量為20 μg，進行SDS-PAGE電泳，隨后通過電轉將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉膜。一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。最后，用ECL化學發光底物進行發光顯影，用Image J軟件對所得圖像進行蛋白質條帶的半定量分析。

2.10 統計學處理

本文均采用GraphPad Prism5.01軟件對所得實驗數據進行統計分析，多組之間的數據應用One-way ANOVA對其進行檢測，P<0.05表示有統計學意義；P<0.01表示有顯著性差異；P<0.001表示有極顯著差異。

3 結果

3.1 AILBL的體外抗氧化能力

經化學法和HPLC及LC-MS分析檢測表明本實驗研究所用枸杞葉有效成分AILBL是一組以黃酮類化合物為主要成分的天然抗氧化物[5]。采用ABTS法檢測總抗氧化的結果如圖1所示，隨著樣品濃度的增加，樣品對ABTS+·的清除率不斷增加，最后趨于平緩。經HP-20大孔樹脂純化后的枸杞芽葉有效成分(AILBL)清除ABTS+·的能力顯著高于枸杞芽葉有效成分粗提液(Crude AILBL)(P<0.001)，在1 mg/mL時。通過GraphPad Prism軟件計算可知Trolox和AILBL的ABTS+·半數清除濃度EC50分別是0.5679和0.6554mg/mL，AILBL粗提液和蘆丁的ABTS+·半數清除濃度EC50均大于2 mg/mL，由此可知四種物質清除ABTS+·的能力順序為：Trolox>AILBL > AILBL粗提液>蘆丁。

圖1 不同濃度樣品對ABTS+·清除能力Fig.1 ABTS+· scavenging ability in different concentrations of samples

DPPH法檢測總抗氧化的結果如圖2所示，經HP-20大孔樹脂純化后的AILBL清除DPPH·能力顯著高于AILBL粗提液(P<0.001)。隨著樣品濃度的增加，樣品對DPPH·清除率不斷增加，最后趨于平緩。通過GraphPad Prism軟件計算可知純化后的AILBL、AILBL粗提液、Trolox以及蘆丁的DPPH·半數清除濃度EC50分別是0.236 6、0.870 8、0.715 4、0.455 2 mg/mL，由此可知四種物質清除DPPH·的能力順序為：AILBL >蘆丁>Trolox >AILBL粗提液。

3.2 AILBL對急性酒精性損傷肝功能的保護作用

與正常對照組相比，酒精模型組小鼠血清中ALT和AST活性極顯著增加(P<0.001)。與酒精模型組相比，陽性藥對照組和AILBL給藥組均能不同程度地降低小鼠血清中ALT和AST活性，差異具有統計學意義，且AILBL效果呈現劑量依賴性降低，其中AILBL高劑量組降低效果最為明顯(P<0.001)，ALT和AST分別降低了35.08%和27.98%(如表1所示)。可見，AILBL通過降低急性酒精性肝損傷引起的小鼠血清中ALT和AST活性增加進而起到保護肝功能的作用。

圖2 不同濃度樣品對DPPH·清除能力Fig.2 DPPH· scavenging ability in different concentrations of samples

表1 AILBL對酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響Table 1 Effects of AILBL on serum ALT and AST in mice with alcoholic liver injury

3.3 AILBL對酒精性肝損傷小鼠氧化損傷的保護作用

與正常對照組相比，酒精模型組小鼠肝臟MDA含量升高2.42倍、GSH含量降低了48.17%(P<0.001)。與酒精模型組相比，陽性藥對照組和AILBL給藥組均能不同程度地降低小鼠肝臟MDA含量和升高小鼠肝臟中GSH含量，且AILBL效果呈現劑量依賴性，差異具有統計學意義(如表2所示)。由此可見，AILBL能顯著降低酒精性肝損傷小鼠的MDA水平，促進GSH再生，增強肝臟自由基的清除能力，從而減少由于體內過氧化產物堆積造成對肝臟的“二次打擊”損傷，保護肝臟的功能[8]。

表2 AILBL對酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA和GSH含量的影響Table 2 Effects of AILBL on hepatic MDA and GSH in mice with alcoholic

3.4 AILBL對酒精性肝損傷小鼠肝組織病理學的影響

如圖3所示，正常對照組(圖3A)小鼠的肝細胞形態結構完整，肝細胞未發生脂肪變性。酒精模型組(圖3B)肝形態細胞結構不完整，細胞間排列紊亂，細胞間的界限模糊不清，肝細胞腫大，細胞與細胞之間的間隙變大，胞漿呈空泡狀，脂滴累積增多，發生明顯的氣球樣脂肪變性。陽性藥對照組(圖3C)、AILBL低劑量組(圖3D)、AILBL中劑量組(圖3E)和AILBL高劑量組(圖3F)均能不同程度地減少胞漿內的空泡與脂滴，氣球樣脂肪變性得到緩解。其中AILBL高劑量組恢復效果最為明顯，幾乎恢復至正常對照組水平。以上結果提示，AILBL可以有效減輕乙醇誘導產生的小鼠肝臟脂肪病變。

圖3 AILBL對酒精性肝損傷小鼠肝組織形態結構的影響(×400)Fig.3 Effect of AILBL on hepatic morphology in mice with alcoholic liver injury (×400)注：A：正常對照組；B：酒精模型組；C：陽性藥對照組；D：AILBL低劑量組；E：AILBL中劑量組；F：AILBL高劑量組；紅色箭頭：細胞核固縮；黑色箭頭：脂肪空泡。Note:A:Control;B:Ethanol;C:Silymarin;D:L-AILBL;E:M-AILBL;F:H-AILBL;Red arrow:Nuclear pyknosis;Black arrow:Fat vacuole.

圖4 AILBL對酒精性肝損傷中氧化應激相關蛋白的影響(×200)Fig.4 Effect of AILBL on oxidative stress-related proteins in alcoholic liver injury (×200)注：A：正常對照組；B：酒精模型組；C：陽性藥對照組；D：AILBL低劑量組；E：AILBL中劑量組；F：AILBL高劑量組。Note:A:Control;B:Ethanol;C:Silymarin;D:L-AILBL;E:M-AILBL;F:H-AILBL.

3.5 AILBL動物水平的分子機制

氧化應激是酒精性肝病發生的重要因素之一，CYP2E1作為一種重要的肝代謝酶，能誘發過量ROS的產生，促進氧化應激的出現。圖4表明，酒精刺激后，肝臟中CYP2E1表達明顯增多，而陽性藥水飛薊素和AILBL給藥組均能不同程度抑制酒精誘發的CYP2E1升高。AILBL給藥組中高劑量300 mg/kg的效果最好，顯著的降低CYP2E1的表達。同時，AILBL能抑制氧化應激相關的缺氧蛋白HIF-1α和iNOS的蛋白表達。

3.6 細胞水平的分子機制研究

如圖5所示，與正常對照組相比，400 mM乙醇刺激HepG2細胞24 h后，ROS明顯升高，而AILBL(20、40 μg/mL)預給藥6 h能顯著減少ROS的累積，這表明AILBL能有效緩解乙醇刺激引起的氧化應激。同時，AILBL(20、40 μg/mL)預防給藥能明顯抑制乙醇刺激誘發的CYP2E1高表達(圖6)。由此可見，AILBL能通過抑制CYP2E1的表達和ROS的累積來減少氧化應激的發生，從而保護乙醇誘導的肝細胞損傷。

圖5 AILBL減少乙醇刺激HepG2細胞產生的過多ROS(×200)Fig.5 AILBL reduced the excessive production of ROS stimulated by ethanol in HepG2 cell (×200)注：A：正常對照組；B：酒精模型組；C：AILBL低劑量組-20；D：AILBL高劑量組-40。Note:A:Control;B:Ethanol;C:L-AILBL-20;D:H-AILBL-40.

圖6 AILBL降低乙醇刺激誘發的CYP2E1升高Fig.6 AILBL decreased the over expression of CYP2E1 induced by ethanol

4 討論

枸杞是中華傳統經典中藥之一，在詩經、神農本草經、藥性論中經常出現。研究表明，枸杞具有潤肺、益氣、護肝明目等多種藥學功效[5,9,10]。人們較多的研究側重于枸杞子，而對枸杞芽葉的研究相對較少。枸杞子富含枸杞多糖和黃酮類等抗氧化物質，能增強機體的學習記憶能力、抗疲勞能力和免疫力，并能有效清除機體自由基、提高細胞內抗氧化酶活力，保護肝、腎等臟器，從生理生化學等方面對機體起到保護作用[4]。相對于枸杞子，我們的研究發現枸杞葉中的黃酮類化合物含量比枸杞子更高[5]，在體外具有顯著的清除自由基的能力，對ALD實驗動物模型具有很好的防治作用，未來可研制為藥品或保健品，用于ALD的防治。

大約有20%的人在過量或長期飲酒后出現肝損傷，酒精代謝過程中活性氧自由基生成過剩和脂質代謝紊亂是誘發細胞損傷與凋亡的重要因素。當肝臟細胞及線粒體遭遇活性氧自由基攻擊時，細胞內GSH等還原性大分子蛋白質急劇減少、DNA斷裂、線粒體及細胞膜破損[2,8]，細胞中ALT和AST釋放進入血液，因此常用血清ALT和AST含量評價肝臟損傷和肝功能是否正常。本實驗通過連續三次酒精灌胃建立急性酒精性肝損傷模型[3]，本研究發現單獨給予酒精灌胃的模型組小鼠血清ALT和AST均超出正常水平，而給予陽性藥和不同濃度AILBL預防治療組小鼠血清中ALT和AST顯著下降，且給藥組小鼠肝臟組織病理學形態得到良好改善，減少了氧化應激關鍵蛋白CYP2E1的表達，表明AILBL對急性酒精性肝損傷具有很好的保護作用。

AILBL中富含黃酮等多種抗氧化物質[12]，是其發揮抗氧化、保護細胞氧化損傷的重要物質基礎[5,13,14]。本研究發現，AILBL能顯著降低急性酒精性肝損傷小鼠的MDA水平，促進GSH再生，增強肝臟自由基的清除能力，從而減少由于體內過氧化產物堆積造成對肝臟的“二次打擊”損傷，具有顯著的護肝功能。與此同時，AILBL在體外通過抑制CYP2E1表達顯著減少乙醇誘導的ROS累積。

綜上所述，本實驗室通過提取枸杞芽葉中的有效成分并研究其對急性酒精性肝損傷的保護作用發現，AILBL能夠通清除肝細胞中MDA，提高GSH水平，抑制肝細胞中CYP2E1的表達，改善酒精引起的肝臟細胞氧化應激、脂質過氧化和炎癥，從而達到護肝的功效。本研究將會使枸杞葉有效成分成為預防治療ALD等肝病的有效藥物或保健品，為我國中藥現代化研究做出新貢獻。